Визуализация центросомных белков Drosophila во время сперматогенеза является мощным методом для идентификации новых белков критических для центросом биологии, а также для выяснения конкретной функции известных игроков в этом процессе.
Центросомы сохраняются микротрубочек основе органеллы, структура которых и функциональные резко меняться в течение клеточного цикла и дифференцировки клеток. Центросомы имеют важное значение для определения оси деления клеток во время митоза и зарождаются реснички во время интерфазы. Идентичность белков, которые опосредуют эти динамические изменения остается лишь частично известны, а функция многих белков, которые были вовлечены в этих процессах все еще рудиментарным. Последние исследования показали, что дрозофилы сперматогенез предоставляет мощную систему для выявления новых белков критические для центросом функции и формирования, а также, чтобы разобраться в конкретной функции известных игроков в процессах центросомой связаны между собой. Дрозофилы является признанным генетическая модель организм, где мутанты в центросомных гены могут быть легко получены и легко проанализирована. Более того, последние достижения в области чувствительности и разрешения световой микроскопии иРазработка надежных генетически меченых центросомных маркеров превратили способность использовать Drosophila яички как простой и доступной модельной системы для изучения центросомы. Эта статья описывает использование генетически-меченых центросомных маркеров для выполнения генетические экраны для новых центросомных мутантов и, чтобы разобраться в специфической функции вновь выявленных генов.
Drosophila яички являются подходящим система органов для изучения разнообразных клеточных и развития процессов и были рассмотрены широко протяжении многих лет 1-9. Эта рукопись фокусируется на использовании Drosophila яичек для изучения центросому, консервативный сотовой органелл. Как и в других системах, центросома функции Drosophila семенников в митозе, мейоза, и цилиогенеза 10. Центросомы состоят из пары микротрубочек на основе структур, известных как центриолями окруженных сложной сети белка называют pericentriolar материала (PCM). Центриоль пара состоит из старой материнской центриоли и младшая дочь центриоли. Как клетка продвижения к митоза, обе центриоли отделить, не дублировать, и приобрести большое количество ИКМ в конечном счете сформировать два различных центросомы. Центросома содержащий оригинальную материнской центриоли называют материнской центросомы и CENTRosome содержащий оригинальную дочь центриоль называют дочерней центросоме.
Drosophila яички идеально подходят для изучения молекулярной основы центросом биологии на флуоресцентной микроскопии для целого ряда причин.
Вместе указанное выше характеристики Drosophila яичек предоставляет модель, где центросома можно изучать с помощью легкого, быстрого и детального изображения. Методики, описанныев данной работе были применены для исследования многих аспектов центросомы биологии в том числе центриолей формирования 11 центриолей дублирования 15, набора PCM 16 центросом правила 17 и цилиогенеза 18. Эти методы также применяются для изучения центросому в других областях биологии, таких как мейоза правила 19, шпиндель узла 20 и центросом деятельности в дивизионе асимметричный стволовых клеток 21 и многие другие.
Визуализация яичек в центросомой начинается с получения мух, которые выражают генетически маркированные центросомного белки и выделения яички из мужского личинок, куколок или взрослых мух. Эти мухи доступны из нескольких исследовательских групп 1,11,15,22-25. Личинки яички содержать все этапы сперматогенеза до мейоза и полезны при анализе мутаций, которые смертельны в куколки или взрослого. Однако в конце куколки или молодой адуLt яички являются наиболее надежными и содержать все пред-и пост-мейоза этапы сперматогенеза, тем самым делая их предпочтительным для анализа. Так как число сперматозоидов уменьшается с лету возрастов, использование взрослых семенников также подходит для изучения центросому в контексте старения. 26. Способ выделения семенников от взрослых мух была ранее описана 27.
Визуализация центросомах и их функции в дрозофилы яичек может быть достигнуто с помощью трех взаимосвязанных треков, которые представлены здесь (рис. 3). Выбор дорожки из которых является наиболее подходящим зависит от характера вопроса исследователь адресации.
Трек включает съемку живых яичек. Это наиболее быстрый из трех дорожек, но может быть применен только когда образцы не должны быть сохранены и иммунного окрашивания, когда не требуется. В Track А, яички установлены (нетронутыми, пирсинг или вырезать) на слайдахи осторожно раздавленный под покровным что они образуют единый слой легко идентифицируемых сот. Затем клетки визуализировали с использованием как фазово-контрастной микроскопии и флуоресцентной микроскопии. Использование поэтапного отличие особенно важно для анализа Drosophila яичек, потому что это показывает сотовой информацию, которая не видна с другими формами проходящем свете и таким образом позволяет для быстрой идентификации различных стадиях развития сперматозоидов 28,29. Тем не менее, трек имеет два основных недостатка. Во-первых, морфологические целостность клеток часто ставится под угрозу, как только яички разрываются. Во-вторых, нефиксированные клетки иногда перемещаться внутри образца, делая съемку нескольких слоев конфокальной течение определенного региона сложной. Способствовать анализ конкретных типов клеток, яички могут быть пробиты или вырезать, чтобы направить путь яичка разрывы такое, что давя под покровное минимально влияет на морфологию типа клеток, представляющих интерес.
Дорожка B включает химическую фиксацию яичек. Этот трек требует промежуточное количество времени для подготовки образцов и имеет то преимущество, что фиксированные образцы могут быть сохранены для последующего анализа. Кроме того, фиксация служит, чтобы сделать клеточные структуры более жесткой, сводя к минимуму перемещение образца во время съемки. Тем не менее, фазово-контрастной микроскопии становится гораздо менее информативны после химической фиксации, что делает некоторые этапы развития сперматозоидов трудно определить.
Дорожка C является самой трудоемкой, но имеет дополнительное преимущество, что клеточные структуры фиксируются и иммуноокрашиванию, что позволяет для визуализации белков, которые не доступны с соответствующими генетики тегов. Есть много антитела доступные и коммерчески и из различных исследовательских групп для иммуноокрашивания центросомы и центросоме связанных структур в дрозофилы яичек.
Изучение центросом биологию в лету яичек с использованием генетически-тегом центросомного маркеры является полезным методом для оценки центросом функции и деятельность в обоих дикого типа и мутанта контексте. В частности, трек подходит для быстрого скрининга центросомных аномалии, такие как порок, misegregation, нестабильности, или ненормальные длины в целях выявления новых мутантов. Кроме того, сперматиды реснички в живых препаратов остаются подвижными примерно 15 минут после вскрытия и использование живых яичек в Track А также позволяет подвижность сперматозоидов, чтобы быть легко решены. Поскольку активность сперматозоидов подвижных ресничек напрямую связано с центросом функции, анализы могут быть выполнены, чтобы определить влияние различных центросомных мутаций на функции ресничек. Дорожка B может быть использован для более конкретных наблюдений особенно когда статистические данные, необходимые для таких как подсчет количества центриолями на клетку и или количества клеток на кисты. Трек С самых usefuл для детальных наблюдений, которые требуют окрашивания с антителами. Примеры включают маркировку определенного типа клеток, таких как стволовые клетки, окрашивания белка, который не имеет доступный тег например ацетилированного тубулина или для проверки отсутствия или неправильной локализации белка в мутанта.
При визуализации центросомы и центросоме связанных структур, используя генетически маркированные маркеры, а не антитела не только экспериментально проще, но и обеспечивает более надежные и воспроизводимые результаты. Таким образом, использование генетически-меченых центросомных белков является надежным подходом для механистической и количественного анализа, которые требуют большой набор данных. Например, использование генетически-меченых центросомных маркеров было особенно ценно для количественной оценки центриолей длины. Такой анализ показал, что различные мутации могут быть разделены на две категории, основанные на изменчивости в центриолей длины. Одна категория включает в себя мутации, которые чанGE длина центриоль но не влияют на стандартное отклонение 1 и другая категория включает в себя мутации, которые влияют как длину центриолей и стандартное отклонение в длине 11. Такие количественные данные могут предоставить полезную информацию в зависимости от конкретных центросомных генов. Центросомных мутанты, которые обладают длина бракованного центриолей с увеличением стандартное отклонение может быть связано с дестабилизации центриолей структуры. Тем не менее, длина бракованного центриоль с нормальным стандартной ошибки может означать, что мутация не структурно дестабилизировать центриоль и, скорее всего, связано с изменением механизма регулирования контрольного центриолей длину. Из-за несоответствий в иммуноокрашивания, количественный анализ трудно с использованием маркеров антител в одиночку.
Центросома большой, сложный белковый состав и многие из его белков находятся только в его интерьере. Использование генетически-тегами центросомногомаркеры скорее антител позволяет последовательно маркировать внутренние компоненты центросоме которого эпитопы могут быть иначе недоступны для антител маркеров. Например, локализации исследования BLD10 с использованием антител узнает белок обогащаться на дистальных и проксимальных концах центриоль 13, в то время как BLD10-GFP показывает более равномерное распределение 1. Тем не менее, это также важно учитывать уровень экспрессии конкретного генетически-меченого белка, так как это может повлиять на распределение белка. Локализация ПАВ-4-GFP и SAS-6-GFP экспрессировался под их эндогенных ограничивается проксимальных концах центриоль 1,16,35 С другой стороны, САС-4-GFP и SAS-6-GFP экспрессировался под сильный убиквитин промоутер локализованы вдоль всей длины центриолей 12,14. Еще одним важным фактором является влияние генетической метки на функции белка. Анализируя если генетически-меченных белков функциональны может быть TESТед путем введения трансгенных белков в мутанта фоне и изучения, если трансгенные белок спасает фенотип мутанта.
Фиксация Drosophila семенников может быть выполнена с использованием различных химических фиксаторов. Здесь мы описываем фиксацию как с формальдегидом (трек B) и метанол-ацетон (трек C). Однако, как фиксатор может использоваться взаимозаменяемо и поскольку различные фиксаторы могут нарушить химически нативные эпитопы антител, выбор соответствующего фиксатора для иммунным окрашиванием должно быть определено экспериментально. Следующие фиксаторы и условия инкубации обычно используют: 3,7% формальдегида, 5 мин при комнатной температуре; метанол, 15 мин при -20 ° С; ацетон, 10 мин при -20 ° С; метанол, 15 мин при -20 ° C. затем ацетоном, 30 сек при -20 ° С, этанол, 20 мин при -20 ° С. Хотя фиксация смесью ацетон, метанол, этанол и не требуют длительной стадии проницаемости для фиксации иммуноокрашивания, шго формальдегида должны следовать один час инкубации в PBST-B при комнатной температуре в проницаемыми клеточные мембраны и позволит антитела доступ к внутриклеточным эпитопов. Кроме того, некоторые фиксаторы являются более подходящими для конкретных антигенов. Например, функции формальдегида хорошо для фиксации небольших белков, тогда как метанол и ацетон хорошо подходят для фиксации больших молекулярных комплексов 36.
Иммуноокрашивание Drosophila семенников было описано ранее для наблюдения хроматина структуры и микротрубочки цитоскелета 29,37. Здесь (трек С), процедура была оптимизирована для анализа центросомных структур, содержащих генетически-меченных белков. Мы предоставляем подробное описание этой процедуры, чтобы направлять людей, которые не имеют опыта работы в дрозофилы яичек. Эта процедура также включает модификации для улучшения сохранения и морфологию семенников, например, с помощью Siliconized покровные и положительно заряженные предметные стекла микроскопа.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантом (R01GM098394) от НИЗ и Национального Института общей медицинских наук, а также гранта 1121176 от Национального научного фонда.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Positively Charged Slides | AZER Scientific | EMS200A+ | |
Feather Microscalpel | Electron Microscopy Sciences | 72045-30 | |
37% Formaldehyde or Paraformaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Boston Bioproducts | BM-220 | |
18×18 mm coverslips number 1.5 | VWR | 48366 205 | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 ml | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-100ML | |
BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
RNAse A | 5 prime | 2900142 | |
Filter paper | Whatman | 1001-055 | |
Glass engraver | Dremel | 290-01 | |
TCS SP5 confocal microscope | Leica | ||
Mounting Media | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
Immuno Stain Moisture Chamber, Black | Electron Microscopy Sciences | 62010-37 | |
Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 |