Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

Summary

Os celulossomos são complexos multienzimáticos projetados para digerir celulose. O SMFS baseado em AFM foi usado para estudar as propriedades mecânicas e a configuração de dobramento de conjuntos de proteínas associadas ao celulossomo. Apresentamos um fluxo de trabalho completo para imobilização de proteínas, aquisição de dados e análise de dados para estudar as interações de complexos receptor-ligante individuais envolvidos na montagem do celulosomo.

Abstract

Os celulossomos são complexos multienzimáticos discretos usados por um subconjunto de bactérias anaeróbicas e fungos para digerir substratos lignocelulósicos. A montagem das enzimas na proteína de andaime não catalítica é dirigida por interações entre uma família de pares receptor-ligante relacionados compreendendo módulos de coesina e dockerina em interação. A ligação extremamente forte entre os módulos coesina e dockerina resulta em constantes de dissociação na faixa de picomolar a nanomolar baixo, o que pode dificultar medições precisas fora da taxa com métodos convencionais em massa. A espectroscopia de força de molécula única (SMFS) com o microscópio de força atômica mede a resposta de biomoléculas individuais à força e, em contraste com outros métodos de manipulação de molécula única (ou seja, pinças ópticas), é ideal para estudar interações receptor-ligante de alta afinidade devido à sua capacidade de sondar o regime de alta força (>120 pN). Aqui apresentamos nosso protocolo completo para estudar montagens de proteínas celulossômicas no nível de molécula única. Usando uma topologia de proteína derivada do celulossomo nativo, trabalhamos com proteínas de fusão enzimática-dockerina e módulo de ligação a carboidratos-coesina (CBM-coesina), cada uma com um grupo tiol livre acessível em um resíduo de cisteína projetado. Apresentamos nosso protocolo de imobilização de superfície específico do local, juntamente com nosso procedimento de medição e análise de dados para obter parâmetros de ligação detalhados para o complexo de alta afinidade. Demonstramos como quantificar as forças de desdobramento de subdomínio único, forças de ruptura complexas, taxas de desligamento cinéticas e larguras potenciais do poço de ligação. A aplicação bem-sucedida desses métodos na caracterização da interação coesina-dourina responsável pela montagem de complexos celulolíticos multidomínio é descrita mais adiante.

Introduction

Cellulossomos são grandes complexos multienzimáticos exibidos na superfície de bactérias celulolíticas anaeróbicas (por exemplo, C. thermocellum) que evoluíram para despolimerizar eficientemente a lignocelulose da parede celular vegetal em oligossacarídeos solúveis¹. Um atributo central dos celulossomos é a interação coesina-dockerina de alta afinidade. No paradigma mais proeminente, um módulo de dospina de 60-75 aminoácidos tipo I altamente conservado é exibido na extremidade C-terminal das várias enzimas bacterianas. O módulo dockerin direciona a montagem de combinações sinérgicas de enzimas para a proteína de andaime não catalítica ('sc....

Protocol

Um esquema da geometria de tração usada neste trabalho para sondar a interação coesina-dockerina é mostrado na Figura 1A. O protocolo de imobilização de proteínas aqui relatado para a funcionalização do cantilever e da lamínula é uma versão modificada do procedimento publicado anteriormente²⁷. As proteínas foram expressas a partir de vetores plasmidiais em E. coli usando métodos convencionais. As proteínas foram projetadas com um grupo tiol acessível a solventes, que foi usado em combinação com a química da maleimida para amarrar a proteína por meio de uma ligação estável de tioéter à superfície da lamínula e ao cantilever. Os resí....

Results

Usamos o procedimento descrito para investigar um par coesina-dourina tipo I de C. thermocellum. Após a ligação bem-sucedida do par coesina-dockerina, os traços de distância de força registrados mostraram padrões de pico característicos. Um traço típico é mostrado na Figura 4a. Cada pico no traço representa o desdobramento de um subdomínio de proteína, com o último pico correspondendo à dissociação do complexo receptor-ligante.

Para o complexo CBM-coesina-dockerina-xi.......

Discussion

Para obter dados significativos de experimentos de espectroscopia de força de molécula única, é crucial obter geometrias de tração bem definidas e reprodutíveis. O protocolo usado aqui resulta na imobilização específica do local de complexos de proteínas em uma geometria de tração definida.

Os balanços utilizados neste estudo foram escolhidos devido à sua sensibilidade à força e alta frequência de ressonância na água. Além disso, a pequena curvatura da ponta de aproximadamente 10 nm é vantajos.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropil dimetil etoxissilano	ABCR GmbH	AB110423
5 kDa NHS-PEG-maleimida	Rapp Polymer	13 5000-65-35
TCEP Gel redutor de dissulfeto	Thermo Scientific, Pierce	77712	www.thermoscientific.com/pierce
Tris(hidroximetil)aminometano
BioLever mini cantilevers de nitreto de silício	Olympus	BL-AC40TS-C2	Lotes macios
XYZ Atuadores piezoelétricos	Physik Instrumente GmbH
Infravermelho " amplo espectro" Laser IR	Superlum
MFP-3D AFM Controller	Asylum Research
Igor Pro 6.31	Wavemetrics		Aquisição e análise de dados
Cloreto
sódio Cloreto
cálcio Medidor de pH Borato
			de sódio
Pinças
Óculos de cobertura	Thermo Scientific, Menzel-Glä ser		24 mm de diâmetro, 0,5 mm de espessura
Porta-amostras			feito sob medida
Banho
Pureza analítica	etanol
Ácido sulfúrico (concentrado)			pureza analítica
Peróxido de hidrogênio (30%)			pureza analítica
Agitador orbital
Tolueno			analítica
Papel
Lâminas
Microtubos
Micropipetas
Centrífuga			adequada para microtubos
Rotador
			de Petri
Béqueres
Microscópio