मानव थाइमस से माइलॉयड वृक्ष के समान कोशिकाओं और उपकला कोशिकाओं का अलगाव
Summary
इस प्रोटोकॉल प्रतिजन घनत्व एकल कक्ष निलंबन की centrifugation और ब्याज की सेल आबादी के अंत में चुंबकीय और / या FACS छँटाई के द्वारा पीछा ऊतक के enzymatic पाचन के विभिन्न चरणों के माध्यम से मानव थाइमस से कोशिकाओं को पेश करने को अलग करने के लिए एक विधि का विवरण.
Abstract
इस प्रोटोकॉल में हम मानव थाइमस से वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) और उपकला कोशिकाओं (टीईसी) को अलग करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं. डीसी और टीईसी प्रमुख प्रतिजन पेश सेल एक सामान्य थाइमस में पाया (एपीसी) प्रकार के होते हैं और यह अच्छी तरह से वे thymic चयन के दौरान अलग भूमिकाएं निभाते हैं स्थापित है. इन कोशिकाओं को थाइमस में अलग microenvironments में स्थानीय और प्रत्येक एपीसी प्रकार की कोशिकाओं की ही एक नाबालिग आबादी का निर्माण करता रहे. आगे इन सेल प्रकार के जीव विज्ञान को समझने के लिए, इन सेल आबादी के लक्षण वर्णन बहुत ही वांछनीय है लेकिन वजह से उनके कम आवृत्ति करने के लिए, इन प्रकार की कोशिकाओं में से किसी के अलगाव के लिए एक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रक्रिया की आवश्यकता है. इस प्रोटोकॉल विविध सेलुलर गुणों के लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक विधि का विवरण. Thymic ऊतक यंत्रवत् बाधित है और enzymatic पाचन के विभिन्न चरणों के बाद, जिसके परिणामस्वरूप सेल निलंबन एक Percoll घनत्व centrifugation कदम का उपयोग समृद्ध है. माइलॉयड डीसी (CD11c के अलगाव के लिए <समर्थन> +), कम घनत्व अंश (एलडीएफ) से कोशिकाओं को चुंबकीय सेल छँटाई के द्वारा immunoselected रहे हैं. टीईसी आबादी (Mtec, CTEC) के संवर्धन विशेष सेल मार्कर का उपयोग छंटनी (FACS) प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल के माध्यम से उनके बाद अलगाव की अनुमति कम घनत्व Percoll सेल अंश से hematopoietic (CD45 हाय) कोशिकाओं की कमी से हासिल की है. अलग कक्षों अलग बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
थाइमस टी सेल विकास है जिसमें वह अंग है. Thymic गतिविधि अभी भी बुढ़ापे में पता लगाया जा सकता है, हालांकि यह क्रमिक वसा से बदल जाता है जब उसके रिश्तेदार और पूर्ण आकार उम्र के साथ कम हो जाती है. प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए इसके महत्व जल्दी 1960 1 में प्रदर्शन किया गया.
टी सेल प्रदर्शनों की सूची एक कार्यात्मक और काफी हद तक आत्म सहिष्णु टी सेल प्रदर्शनों की सूची 2 में जिसके परिणामस्वरूप, टी कोशिकाओं को विकसित करने के लिए अस्तित्व या मौत cues प्रदान जो thymic एपीसी के विभिन्न प्रकार, पर पेप्टाइड MHC परिसरों के साथ टी सेल रिसेप्टर्स की बातचीत के माध्यम से आकार का है.
मानव थाइमस में कोशिकाओं के लगभग 98% thymocytes के रूप में भेजा टी कोशिकाओं को विकसित कर रहे हैं. शेष 2%, एक टीईसी की किस्म (cortical, दिमाग़ी, subcapsular), माइलॉयड और plasmacytoid डीसी (एमडीसी, पीडीसी), मैक्रोफेज, बी कोशिकाओं, परिपक्व परिसंचारी टी कोशिकाओं, granulocytes सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के एक नंबर से मिलकर चएक अभिव्यक्ति phenotype के साथ ibroblasts, endothelial कोशिकाओं और बहुत दुर्लभ उपकला कोशिकाओं मांसपेशी, न्यूरॉन्स और श्वसन उपकला के रूप में अन्य ऊतकों (चित्रा 1) से कोशिकाओं की कि जैसी. इनमें से, टीईसी और डीसी एक सामान्य थाइमस में पाया प्रमुख एपीसी प्रकार के होते हैं. हाल के वर्षों में, संस्कृति और आणविक रूपरेखा के लिए इन एपीसी प्रकार की शुद्धि अधिक से अधिक ब्याज का फायदा हुआ है. कारण उनके कम आवृत्ति के लिए, विस्तृत विश्लेषण के लिए इन प्रकार की कोशिकाओं में से किसी का अलगाव एक कुशल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और लागत प्रभावी प्रक्रिया की आवश्यकता है. यहाँ प्रस्तुत पद्धति पहले से प्रकाशित अध्ययन 3,4 से एक संशोधन है.
किसी भी अन्य ऊतकों के साथ के रूप में, थाइमस से सेल निष्कर्षण enzymatically एकल कक्षों के निलंबन को प्राप्त करने के लिए, सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत नेटवर्क disaggregating द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. अच्छा हदबंदी दक्षता, सेल उपज, सेल व्यवहार्यता और सेल एस की अवधारण की तरह कुछ मानकों हैंमहत्वपूर्ण हैं और कि urface मार्करों इन दुर्लभ सेल आबादी के सफल अलगाव के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
इस प्रोटोकॉल में, डीसी और टीईसी सबसेट के अलगाव यांत्रिक विघटन और enzymatic पाचन द्वारा ऊतकों की एक एकल कक्ष निलंबन बनाकर किया जाता है. हम ऊतक एक साथ धारण कि देशी कोलेजन नीचे तोड़ने के लिए, अलग एंजाइम की गतिविधियों का एक संतुलित अनुपात है जो क्लोस्ट्रीडियम histolyticum, से Collagenase एक का उपयोग करें. DNase मैं (thymocytes बहुत संवेदनशील होते हैं). हम भी एक ऊतक dissociator द्वारा सहायता प्रदान की यांत्रिक और enzymatic ऊतक उपचार से जुड़े ठेठ एंजाइमी ऊतक पाचन के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान वजह से मृत कोशिकाओं से मुक्त डीएनए के लिए सेल एकत्रीकरण कम करने के लिए एंजाइम समाधान में शामिल है. एकल कक्ष निलंबन तो कोशिकाओं के कम घनत्व अंश (एलडीएफ) के संवर्धन के लिए एक एकल Percoll घनत्व centrifugation के अधीन है. कोशिकाओं के इस अंश से, डीसी च धुंधला द्वारा अलग किया जा सकता हैया डीसी सतह मार्कर (यानी CD11c +) और चुंबकीय जुदाई या प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग कर. थाइमस में कोशिकाओं के विशाल बहुमत शामिल lymphoid कोशिकाओं के विपरीत, टीईसी उच्च स्तरों पर CD45 व्यक्त, लेकिन उपकला कोशिका आसंजन अणु EpCAM के लिए सकारात्मक रहे हैं नहीं है. CTEC सीडीआर -2 (cortical वृक्ष के समान reticulocyte -2) प्रतिरक्षी 4,5 और कुछ हद तक कम EpCAM अभिव्यक्ति द्वारा मान्यता प्राप्त एक अभी तक अपरिभाषित प्रतिजन की अभिव्यक्ति से मस्तिष्क का टीईसी से प्रतिष्ठित किया जा सकता. अंतर EpCAM और CDR2 के सह अभिव्यक्ति उच्च गति सेल के माध्यम से इन टीईसी कैंपेन्स के कुशल अलगाव 6 छँटाई की अनुमति देता है.
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मानव thymic ऊतक के लिए अनुकूलित है. FACS छँटाई प्रयोग किया जाता है, तो प्रक्रिया की अवधि, ऊतक की मात्रा और प्रयोगकर्ता की क्षमता के साथ ही सेल सॉर्टर की गति पर निर्भर करता है. आम तौर पर, डीसी के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल 5 के भीतर पूरा किया जा सकता है-6 घंटा और 8-10 घंटे में टीईसी के अलगाव के लिए. thymic ऊतक से डीसी और टीईसी सबसेट के अलगाव के समय के प्रति संवेदनशील है. तेजी से अलगाव की प्रक्रिया, कक्षों की हालत बेहतर है. अंत में, अलग कक्षों तुलनात्मक mRNA की पढ़ाई और प्रोटीन अभिव्यक्ति, पीसीआर प्रयोगों, प्रोटीन अलगाव, आणविक रूपरेखा (यानी transcriptomics, माइक्रो आरएनए विश्लेषण) के साथ ही सेल संस्कृति 6 की तरह आगे की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
आचार विवरण
मानव थाइमस ऊतक के साथ काम करने के लिए सक्षम होने के लिए आदेश में शोधकर्ता ऊतक आमतौर पर उम्र के अंतर्गत से प्राप्त होता है के बाद से स्थानीय आचार समिति या जिम्मेदार अधिकारियों और साथ ही दाता के एक सूचित लिखित अनुमति (या आमतौर पर अपने या अपने माता पिता, से अनुमोदन प्राप्त करने की जरूरत है बच्चों). इसके अलावा, सभी मानव ऊतकों संभावित संक्रामक और उचित उपाय आदि जैसे, दस्ताने के साथ काम कर के रूप में लिया जाना चाहिए होने के रूप में नियंत्रित किया जाना चाहिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल Gotter एट अल 4 द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल के एक संशोधन है. प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हालत और ऊतकों की प्रारंभिक तैयारी के साथ ही Percoll घनत्व जुदाई हैं. हम दृढ़ता से जितनी जल्दी …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम CDR2 एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए थाइमस नमूने और ब्रूनो Kyewski (DKFZ, हीडलबर्ग, जर्मनी) के साथ हमें प्रदान करने के लिए छाती रोगों और हृदय सर्जरी विभाग, विश्वविद्यालय क्लिनिक Tuebingen के सर्जनों के लिए आभारी हैं. हम भी छँटाई सुविधा (Tuebingen विश्वविद्यालय) से हंस Jörg Bühring और सबरीना ग्रिम धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम SFB 685 और Hertie फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Reagents and Materials | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Dulbecco's PBS | PAA | H15-002 | |
| Fetal Bovine Serum-Gold | PAA | A15-151 | |
| Bovine Serum Albumin | PAA | K41-001 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I, grade II bovine pancreatic | Roche | 10 104 159 001 | |
| Trypsin-EDTA 10x in PBS | PAA | L11-001 | stock conc. 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit | Molecular Probes | A-10235 | |
| anti-human CDR2 (purified) | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany | labeled with Alexa Fluor 488 | |
| anti-human CD45 (Pacific Blue) | Biolegend | 304022 | |
| anti-human EpCAM (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| anti-human CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| anti-CD45 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for tissue dissociator |
| Percoll (density 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells |
| 0.22 μm filter | Millex GS | SLGS033SS | Syringe driven |
| Stericup filter unit | Millipore | SCGPU05RE | Pump driven |
| 50 ml PC oak ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP conical tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm x 75 mm 5 ml test tubes | Becton Dickinson | 352058 | FACS stainings |
| Cell strainer 70 μm | Becton Dickinson | 352350 | |
| INSTRUMENTS | |||
| Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (rotor) | Kendro | ||
| Rotator REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | tissue dissociator |
Referências
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