Lipoxygenas (LOX) isozymer kan generera produkter som kan öka eller minska neuroinflammation och neurodegeneration. En gen-miljö interaktion studie kan identifiera LOX isozyme-specifika effekter. Genom att använda 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) modellen av nigrostriatal skada i två LOX isozym-bristfälliga transgena linjer möjliggör jämförelse av bidraget från LOX isozymer på dopaminerg integritet och inflammation.
Lipoxygenas (LOX) verksamhet har varit inblandad i neurodegenerativa störningar såsom Alzheimers sjukdom, men dess effekter i Parkinsons sjukdom (PD) patogenes är mindre förstådda. Modeller för interaktion mellan gen och miljö har nytta av att avslöja effekterna av specifika cellulära vägar i toxicitet som kanske inte observeras enbart med hjälp av en enbart genetisk eller toxikant sjukdomsmodell. För att utvärdera om distinkta LOX-isozymer selektivt bidrar till PD-relaterad neurodegeneration kan transgena (dvs. 5-LOX och 12/15-LOX-bristfälliga) möss utmanas med ett toxin som efterliknar cellskada och död i sjukdomen. Här beskriver vi användningen av ett neurotoxin, 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), som producerar en nigrostriatal lesion för att klargöra de distinkta bidragen från LOX isozymer till neurodegeneration relaterade till PD. Användningen av MPTP i mus, och nonhuman primat, är väletablerad för att rekapitulera nigrostriatal skada i PD. Omfattningen av MPTP-inducerad lesioning mäts genom HPLC analys av dopamin och dess metaboliter och semi-kvantitativa western blot analys av striatum för tyrosin hydroxylase (TH), det hastighetsbegränsande enzymet för syntesen av dopamin. För att bedöma inflammatoriska markörer, som kan visa LOX isozym-selektiv känslighet, stödjeceller fibrillary sura protein (GFAP) och Iba-1 immunohistokemi utförs på hjärnsektioner som innehåller substantia nigra och GFAP Western blot analys utförs på striatal homogenates. Detta experimentella tillvägagångssätt kan ge nya insikter i gen-miljö interaktioner underliggande nigrostriatal degeneration och PD.
Användning av modeller för genmiljöinteraktion ger en metod för att efterlikna riskfaktorer som sannolikt påverkar idiopatisk Parkinsons sjukdom (PD) och ger en möjlighet att urskilja mekanistiska insikter som sannolikt inte kommer att klargöras enbart genom användning av ett genetiskt eller toxiskt system1,2. Här illustrerar vi denna punkt och beskriver tillämpningen av musmodellen 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) av nigrostriatal degeneration3 för att bättre förstå selektiviteten av lipoxygenas (LOX) isozym aktivitet på neuroinflammation ochtoxicitet 4. Medan en roll för LOX isozymer har utvärderats i stor utsträckning i periferastörningar 5,6 samt CNS sjukdom inklusive stroke7 och Alzheimers sjukdom8,9, rollen av familjen av isozymer i nigrostriatal funktion och degeneration relaterade till PD är inte väl förstådd och motiverar studie. MPTP neurotoxin visar förmånlig degeneration av nigrostriatal utbildningsavsnittet och rekapitulerar striatal dopamin utarmning och nigral dopaminerg cellförlust som ligger till grund för motoriska nedskrivningar hos PD patienter10. Medan denna modell inte reproducerar hela kadern av nonmotor och motor PD beteenden och frank α-synuklein-positiv Lewy kroppspatologi, Det har varit användbart att klargöra nya mekanistiska mål som bidrar till nigrostriatal skada och för tidiga translationella tester eftersom det är den bäst karakteriserade noninvasive modellen tillgängliga för att tillförlitligt producera nigral celldöd åtföljd av striatal dopamin förlust11-15. Bred användning av MPTP-musen, med paradigm som sträcker sig från akut, subakuteradtill kronisk 16-18, har gjort det möjligt för standardisering av dosering att resultera i mild till svår nigrostriatalskada 19,20 med aktivering av olika mekanismer för toxicitet beroende på behandlingsregimen18,21,22. Detta gör det möjligt att rikta in sig på ett “lesionsfönster” som kan leda till förstärkt eller minskad nigrostriatal skada beroende på det terapeutiska medlet eller den transgena modellensom används 23–25.
Också viktigt för translationella och upptäcktsbiologiska studier är de tekniker som används för att bedöma skador och de bevis som sådana metoder ger. För MPTP mus modell, etablerade mätvärden för att utvärdera lesionering är mätning av markörer av striatal dopaminerg ton, inklusive dopamin och dess metaboliter av HPLC, och western blot analys av tyrosin hydroxylase (TH), det hastighetsbegränsande enzymet i dopaminsyntesen och indikatorer på degenerativa händelser såsom gliaaktivering med hjälp av western blot analys och immunohistokemi4. Även om dessa är klassiska neurokemiska, biokemiska och histologiska förfaranden, teknikerna ger kritiska och reproducerbara avläsningar om omfattningen av skador inom den nigrostriatala dopaminerga vägen, indikerar mekanismer för toxicitet och har visat sig vara värdefulla verktyg för att förstå degenerativa händelser i PD.
Utformningen av denna gen-miljö interaktion studie gjorde det möjligt för oss att få ny information om den dubbla karaktären av 5-LOX isozym i nigrostriatal utbildningsavsnittet. Genom att utföra HPLC för att mäta striatala monoaminer efter saltlösning eller MPTP behandling i transgenics saknar 5-LOX isozym och deras wildtype littermates, vi kunde notera att dess brist verkar vara skyddande under giftiga förhållanden (Figur 1), men under normala förhållanden minskar bristen på enzymet stri…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av National Institutes of Health NIGMS 056062.
1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) | Sigma-Aldrich | M0896 | for PD modeling | |
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) | American MasterTech Scientific | BUP0157 | for immersion fixation | |
Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC acid extraction | |
Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | for tissue homogenization | |
Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E1644 | for tissue homogenization | |
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | for tissue homogenization | |
Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P5726 | for tissue homogenization | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | for Lowry protein assay | |
Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389 | for cryoprotection | |
Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | for IHC | |
BCA Protein Assay Kit | Pierce/Thermo | 23225 | for protein determination | |
Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well | Invitrogen/Life Technologies | EC60052BOX | for SDS-PAGE | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | for SDS-PAGE | |
Novex Sharp Prestained Protein Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5800 | protein ladder | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for SDS-PAGE | |
Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | for SDS-PAGE | |
Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent | American MasterTech Scientific | SPM1057C | methanol for transfer | |
Sodium chloride (NaCl), ACS reagent | Sigma-Aldrich | S9888 | saline and buffers | |
Nonfat dry milk powder | Carnation | n/a | for immunoblotting | |
Ponceau S solution in 5% acetic acid | Sigma-Aldrich | P7170 | for immunoblotting | |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal | Chemicon/Millipore | AB1542 | for immunofluorescence | |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | for immunoblotting | |
Anti-β Actin, rabbit | Sigma-Aldrich | A2066 | for immunoblotting | |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal | Chemicon/Millipore | AB5804 | for immunofluorescence | |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal | Covance Inc. | SMI-22R | for immunoblotting | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunoblotting | |
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated | Fisher Scientific | 31462 | for immunofluorescence | |
goat anti-sheep, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31480 | for immunofluorescence | |
goat anti-mouse, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31430 | for immunofluorescence | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce/Thermo | 34078 | for immunoblotting | |
CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in | Pierce/Thermo | 34089 | for immunoblotting | |
Restore Western Blot Stripping Buffer | Pierce/Thermo | 21059 | for immunoblotting | |
Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | C1909 | for IHC | |
Normal Donkey Serum | Millipore | S30-100ML | for IHC | |
Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Sigma-Aldrich | P5288 | for IHC | |
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized | Sigma-Aldrich | A3294 | for IHC | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-01 | for IHC | |
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled | Invitrogen/Life Technologies | A10042 | for IHC | |
Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC | Jackson ImmunoResearch | 713-095-147 | for IHC | |
VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | for IHC | |
Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ML | for IHC | |
VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) | Vector Laboratories | PK-4001 | for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions ) | |
DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine | Vector Laboratories | SK-4100 | for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use) | |
Hydrogen peroxide, 30% | Sigma-Aldrich | 216763 | for quench step in IHC | |
Rabbit anti-Iba1 | Biocare Medicals | CP290A | for IHC | |
Cresyl Violet Solution, Regular Strength | FD Neurotechnologies | PS102-01 | counterstain for Iba1 IHC | |
95% Ethanol, reagent alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | dehydration for IHC | |
100% Absolute ethanol | Mallinckrodt | 7019-10 | dehydration for IHC | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | destaining for IHC | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | clearing agent for IHC | |
DPX Mountant | Sigma-Aldrich | 06522 | mounting medium for DAB IHC | |
O.C.T. Compound – Frozen Section Embedding Medium | American MasterTech Scientific | EMOCTCS | embeddium medium for cryostat cutting | |
Potassium permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | to decontaminate DAB solution | |
Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | for HPLC | |
3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) | Sigma-Aldrich | 850217 | for HPLC | |
Homovanillic acid (HVA) | Sigma-Aldrich | H1252 | for HPLC | |
Perchloric acid (PCA) – 70% | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Sigma-Aldrich | 71504 | for HPLC | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | for HPLC | |
1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) | Sigma-Aldrich | O8380 | for HPLC | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | for HPLC | |
Acetonitrile | EMD | AX0145-1 | for HPLC | |
HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) | Millipore | for HPLC | ||
0.22 µm GSTF membrane | Millipore | for filtration | ||
Corning Netwells | Sigma-Aldrich | CLS3477 | polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC | |
[header] | ||||
Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) | MSE | MSE.41371.274 | ||
Microcentrifuge | Eppendorf | 5414R | ||
ESA MD-150 reverse-phase column | ESA | |||
HPLC Pump (Ultimate 3000) | Dionex | ISO-3100BM | ||
HPLC Autosampler (Ultimate 3000) | Dionex | WPS-3000TSL | ||
Electrochemical detector | ESA | Coulochem III | ||
Guard Cell | ESA | 5020 | ||
Analytical Cell | ESA | 5011A | ||
Chromeleon software | Dionex | |||
Eclipse E400 | Nikon | E400 | light/fluorescent microscope | |
Disposable mouse cage | Ancare | N10HT | ||
Microfilter top | Ancare | N10MBT | ||
[header] | ||||
5-LOX- deficient mice | The Jackson Laboratory | 004155 | ||
12/15-LOX-deficient mice | The Jackson Laboratory | 002778 |