Larven av voks møll Galleria mellonella ble nylig etablert som en in vivo modell for å studere Legionella pneumophila infeksjon. Her viser vi grunnleggende teknikker for å karakterisere patogenesen av Legionella i larvene, inkludert vaksinasjon, måling av bakteriell virulens og replikering samt ekstraksjon og analyse av infiserte hemocytes.
Legionella pneumophila, er den utløsende agent for en alvorlig lungebetennelse som heter legionellose, en viktig menneskelig patogen som infiserer og replikerer i alveolære makrofager. Dens virulens avhenger Dot / Icm type IV sekresjon system (T4SS), som er nødvendig for å etablere en replikasjonsgivende vakuole kjent som Legionella innehold vakuole (LCV). L. pneumophila infeksjon kan modelleres i mus, men de fleste musestammer er ikke ettergivende, som fører til jakten på nye smittemodeller. Vi har nylig vist at larver av voks møll Galleria mellonella er egnet for undersøkelse av L. pneumophila infeksjon. G. mellonella brukes i økende grad som en smittemodell for menneske patogener og en god korrelasjon mellom virulens av flere bakteriearter i insekt og i pattedyr modeller. En viktig del av larver immunforsvar er hemocytes, yrkeal fagocytter, som tar opp og ødelegge inntrengerne. L. pneumophila er i stand til å infisere, danner en LCV og replikere i disse cellene. Her viser vi protokoller for å analysere L. pneumophila virulens i G. mellonella modell, inkludert hvordan å vokse smittsomme L. pneumophila, pretreat larvene med hemmere, infisere larver og hvordan du kan hente infiserte celler for kvantifisering og immunfluorescens mikroskopi. Vi beskriver også hvordan å kvantifisere bakteriell replikering og fitness i konkurransebestemmelser. Disse metodene gir mulighet for rask screening av mutanter å bestemme faktorer viktige i L. pneumophila virulens, som beskriver et nytt verktøy for å hjelpe til forståelsen av denne komplekse patogen.
Dyremodeller av infeksjon har vist seg uvurderlig i fastsettelse av bakterielle virulensfaktorer. Men, har virvelløse modeller fått økt oppmerksomhet som et levedyktig alternativ til tradisjonelle pattedyr modeller av infeksjon. Larvene av voks møll, er Galleria mellonella i økende grad benyttet for å studere en rekke viktige humane patogener, inkludert gram-positive 1 og Gram-negative bakterier 2,3 og flere patogene sopper 4,5. Ved hjelp av et insekt-modellen har en rekke fordeler i forhold til tradisjonelle pattedyrmodeller, som et invertebrate, G. mellonella er ikke underlagt de etiske begrensninger av pattedyr modeller. I tillegg kan larvene lett opprettholdes, infisert ved injeksjon uten bedøvelse, gjennomgå forbehandling med kjemiske inhibitorer 6 og opprettholde inkubering ved 37 ° C 7. Interessant, en god korrelasjon mellom patogenitet av flere mikroorganismer i G. mellonella og pattedyr modeller av infeksjon er etablert 2,8. Den økte forståelsen av immunsystemet hos G. mellonella har også bistått i karakterisering av denne modellorganisme. Selv insekter ikke har en adaptiv immunsystem som funnet i pattedyr, har de sofistikerte cellulære og humeral forsvar, inkludert produksjonen av antimikrobielle peptider 9. Hemocytes er den viktigste mediator av cellulære forsvars og er den mest tallrike celletype som finnes i hemolymph (eller blod) i G. mellonella 10, Disse cellene er profesjonelle fagocytter og utføre lignende funksjoner til menneskelige makrofager og nøytrofile ved både å ta opp og nedverdigende bakterier i en PHAGO-lysosomal rommet 10,11 og danner knuter rundt invaderende bakterier, fysisk hindre bakterie replikering 12.
Legionella pneumophila er en luftveis patogen som forårsaker alvorlig pneumonien (legionærsykdom) hos utsatte befolkningsgrupper som eldre eller immunsupprimerte 13. er Legionella finnes overalt i både miljø-og menneskeskapte vannkilder, hvor det er en patogen av ulike arter av ferskvanns amøber 14,15. Legionella overlever og replikerer i disse profesjonelle fagocytter ved å anvende en multi-protein-komplekset kjent som Dot / Icm (defekt i organeller handelen / intracellulære multiplikasjon) type 4 sekresjon system (T4SS) for å translocate over 275 effektor proteiner i vertscellen 16-20. Disse proteinene bidrar til å undergrave den normale vertscellen fagocytiske trasé, som førte til etableringen av Legionella inneholder vakuole (LCV). Den LCV unngår fusjon med lysosomer og i stedet rekrutterer endoplasmatiske retikulum (ER)-avledet vesikler, som resulterer i en spesialisert avdeling som ligner på grov ER 21,22. L. pneumophila er ansett som et utilsiktet menneskelig baneogen; de samme strategiene som tillater det å gjenskape i amøber, også tillate replikering i menneskelige alveolære makrofager 23.
Pattedyr verter har blitt karakterisert som modeller for menneskelig legionellasmitte inkludert mus og marsvin 24,25. Men de fleste av musestammer er bestandige mot Legionella-infeksjon 26 med unntak av innavlet albino A / J mus, som utvikler en mild, selvbegrensende infeksjon 24.. Selv om marsvin-modellen mer ligner human sykdom 25, mangel på mutanter og økt kostnad fraråder bruken 27.. I tillegg har flere virvelløse modeller er utviklet for Legionella pneumophila infeksjon inkludert Caenorhabditis elegans 28, Drosophila melanogaster 29 og flere arter av amøber 30-32. Men disse modellene har svakheter, virulens i C. elegans </em> System er ikke Dot / Icm avhengig 28, noe som begrenser nytten av denne modellen. Drosophila-modellen har vist seg effektiv i å undersøke bakterie virulens faktorer 29 og ser ut til å være lovende men denne modellen er ikke fullstendig karakterisert. Encellede amøber er miljø vertene av L. pneumophila og er ideelle for å undersøke virkningen av virulens faktorer på et molekylært nivå 33 men mangler flere viktige formidlere av pattedyr vertscellen respons på infeksjon som caspases 34. Svakhetene ved de eksisterende modellene, sammen med høye kostnader og etiske bekymringer relatert til pattedyr eksperimentering, har ført til søk etter andre egnede modellorganismer 29,35.
Vi har nylig vist at G. mellonella er en egnet modell for L. pneumophila patogenesen 36,37. Denne protokollen detaljer de eksperimentelle teknikker som brukes for smitteing G. mellonella larver, analysere larve moral, utpakking hemocytes for telling og immunfluorescens og bestemme replikering av levedyktig CFU teller fra infiserte larver.
The Galleria mellonella larve modell for Legionella pneumophila infeksjon er et nyttig verktøy for in vivo studier av patogenesen. Her er det vist at en rekke aspekter av makrofag infeksjon kan recapitulated i G. mellonella modell, inkludert rollen til Dot / Icm T4BSS i virulens og bakteriell replikering og lokalisering av Dot / Icm-effektor SidC. I tillegg, viser vi at en kjemisk inhibitor av aktin polymerisasjon reduserer larve-dødelighet, likne resultatene oppnådd i macophages 47 og støtte bevis på at internalisering av bakteriene er nødvendig for å forårsake larve-dødelighet. Tidligere har det blitt vist at variasjoner i virulens mellom L. pneumophila stammer sett i andre smittemodeller kan verifiseres i G. mellonella og at induksjon av virulensfaktorer i post-eksponensiell vekstfase er nødvendig for bakteriell virulens <sup> 36, noe som bekrefter at G. mellonella er en egnet modell for L. pneumophila infeksjon.
Bestemme CFU av L. pneumophila fra larver infisert enten enkeltvis eller i blandede infeksjoner i stor grad øker anvendeligheten av modellen. Tidligere har flere forhold blitt oppdaget at har subtile effekter på bakteriell replikering i en eller flere modeller av infeksjon 29,48-51. Selv om larvene ikke har en adaptiv immunsystemet, tilstedeværelsen av den medfødte immunrespons gir bedre utvalg sammenlignet med makrofager alene, som kan tjene til å forsterke små fenotyper. Derfor er det mulig at, mens disse stammene vil sannsynligvis ikke i vesentlig grad påvirker larvenes dødelighet, kan de vise redusert bakteriell replikasjon eller anvendelighet i G. mellonella modell. I tillegg til replikasjon av L. pneumophila i larver, har vi vist betydelig hemocyte uttømming sent i infeksjon. Som L.pneumophila er forventet å lysere vertsceller som ved slutten av dets replikasjonssyklus, måle hemocyte uttømming kan også fungere som en indirekte måling av bakteriell replikasjon. Hemocyte uttømming har tidligere vært korrelert med insekt dødelighet i smitte 3,52, selv om nyere resultater tyder på at dette bildet er mer komplekst enn først belived 37. Nylig har det blitt vist at utsulting av larver fører til økt mottakelighet for smitte gjennom en undertrykkelse av immunresponser 53. I assayene som beskrives her, ble larvene ikke matet for varigheten av studien og det er ikke kjent hvor godt matet larver ville svare til L. pneumophila infeksjon.
En av fordelene ved G. mellonella som modellorganisme er den enkle utvinning og kvantifisering av hemocytes fra infiserte larver. Tidligere videoer har vist ulike metoder for å trekke ut hemocytes fra insekter 54,55 imidlertid møtthod presentert her er enkel og egnet for umiddelbar behandling. Når ekstrahert kan hemocytes være lett kvantifiseres, som brukes for immunfluorescens, transmisjonselektronmikroskopi 36 eller strømningscytometri 56 eller kultivert og infisert ex vivo 3 slik at responsen av cellene til infeksjon som skal undersøkes i detalj. Dette øker fleksibiliteten i modellen. En påminnelse til Immunfluorescens i G. mellonella er begrenset tilførsel av antistoffer validert mot G. mellonella proteiner. Studier har imidlertid vist at opprettelsen av antistoffer mot larver proteiner 57 og antistoffer mot humane immunrelaterte proteiner ble funnet å gjenkjenne G. mellonella proteiner 11 som viser potensialet for immunfluorescens på G. mellonella hemocytes.
Den enkle G. mellonella infeksjon gir mulighet for raske, middels gjennomstrømning skjermer som kunnebrukes til å sammenligne virulens av forskjellige Legionella-arter og-stammer, og kan bli brukt for ytterligere å analysere tidligere identifiserte virulens faktorer som adhesjonsmolekyler 58 eller type 2 sekresjon system 59 som er påkrevet for virulens i andre modeller. I tillegg vil bruk av denne modellen tillater identifikasjon og videre karakterisering av nye virulensfaktorer herunder utskilles og translokaliseres effektor-proteiner. Nylig har det blitt vist at fosfolipase C aktivitet av L. pneumophila har en rolle i G. mellonella virulens 60 og at Dot / Icm effektor protein SdhA er nødvendig for virulens 37. I tillegg har vi nylig demonstrert at det er en sammenheng mellom de fenotyper som observeres i G. mellonella og i A / J mus belastning 37.
Dette understreker verdien av dette verktøyet for å komplettere miljø protozo og encellede vert og murine smittemodeller. The G. mellonella modellen vil bli enda mer verdifullt i fremtiden, når larve genomisk sekvens vil være tilgjengelig og flere genetiske verktøy er etablert. Skritt i denne retningen inkluderer fersk publikasjon detaljering immunrelaterte transcriptome 61 og dannelsen av et initiativ for å fremme genet stanse i Lepidoptera spp. 62.
Ved hjelp av G. mellonella larver, har vi en rekke enkle, raske avlesninger av bakteriell virulens som kan brukes til å undersøke patogenesen av L. pneumophila. Etablering av disse analysene og bredere screening av L. pneumophila stammer og serogrupper vil øke nytten av dette nye verktøyet, og vil bidra til vår forståelse av L. pneumophila patogenesen.
The authors have nothing to disclose.
CR Harding ble støttet av Wellcome Trust student WT086724.
Material/ Equipment | |||
ACES yeast extract (AYE) broth | 4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* *add sterile ingredients after autoclaving |
||
Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates | As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar | ||
Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate) | Sigma | P6526 | 0.6 mM solution, sterile filtered |
Sterile cysteine solution | Sigma | C7880 | 3.3 mM solution, sterile filtered |
G. mellonella (waxworms) | Livefood UK | W250 | |
Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC) | Sigma | H9037 | |
Anti-Legionella LPS | Cambridge Biosciences | PA1-7227 | |
Anti-Rabbit IgG Alexa488 | Jackson Immunoreach | 711-485-152 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS) | Sigma | D8662 | |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
Cytochalasin D | Biomol International | BML-T109-0001 | |
[header] | |||
Material | |||
Microtiter Syringe | Sigma | 24544 | |
Cell counter, double, Improved Neubauer | VWR | 631-0926 | |
Centrifuge | For centrifuging plates | ||
Fluorescence microscope | Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores | ||
Inverted microscope | For viable cell counting | ||
Puncture-proof glove | Turtleskin |