זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em> דרוזופילה</em> ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)
Summary
דרוזופילה מפורסמת המניפולציה הגנטית החזקה שלה, אבל לא להתאמתה של אנליזה ביוכימית לעומק. כאן אנו מציגים הליך מבוסס TAP לזהות שותפים באינטראקציה של כל חלבון של עניין ממוח הזבוב. הליך זה עלול להוביל לאפיקים חדשים של מחקר.
Abstract
מסכי גנטיים שנערכו באמצעות דרוזופילה melanogaster (זבוב פירות) יש תגליות אבן דרך רבות בהתקדמות של מדעים ביולוגיים. עם זאת, השימוש במסכים ביוכימי שמטרתה להרחיב את הידע שנצבר מניתוח גנטי שנחקר רק לאחרונה. כאן אנו מתארים שיטה לטיהור החלבון המורכב שמקורביו עם כל חלבון של עניין מראשי זבוב בוגרים. שיטה זו מנצלת את מערכת דרוזופילה Gal4/UAS לבטא חלבון פיתיון התמזגו עם תג טנדם זיקה הטיהור (TAP) בנוירונים זבוב in vivo, ולאחר מכן מיישמת את שני סבבים של טיהור באמצעות הליך TAP דומה לזה שהוקם במקור בשנת שמרי 1 כדי לטהר את החלבון מורכב אינטראקציה. בסופו של הליך זה, תערובת של קומפלקסי חלבונים מרובים מתקבלת אשר מולקולרי זהויות יכולים להיקבע על ידי ספקטרומטריית מסה. אימות של חלבוני המועמד תיהנה מresource וקלות ביצוע מחקרי אובדן של פונקציה בזבובים. ניתן ליישם גישות דומות לרקמות זבוב אחרות. אנו מאמינים כי השילוב של מניפולציות גנטיות וגישת proteomic זה במערכת מודל זבוב בעל פוטנציאל אדיר להתמודדות עם בעיות יסוד בתחום הנוירוביולוגיה ומעבר.
Introduction
הגדרת מסלולים או רשתות המולקולריים שמתווכים תהליך ביולוגי מסוים היא אחת המטרות האולטימטיבית של מחקר ביו. גנטיקאים טוסו הסתמכו רבים על גנטיקה קדימה, במיוחד מתקנים מסכי גנטיים (שניהם משפר והמסכים המדכאים), כדי לזהות גורמים שפועלים יחד, במקביל, או במעלה הזרם או במורד הזרם של גן של עניין. עם זאת, מסכי גנטיקה קדימה לעתים קרובות פעמים לא מצליחים לזהות את הגנים חיוניים אשר, כאשר מוטציה, לגרום הקטלניות בשלבי התפתחות מוקדמים, או גנים עם יתירות פונקציונלית ופיצוי אובדנה של פונקציה היחידה לגרום למומים עדינים שקשה להבקיע. דרך אחת להתגבר על קושי זה היא מסך עבור אינטראקציות בין חלבונים ישירים. במשך יותר מעשור, רשימה הולכת וגדלה של שיטות ביוכימיות, כולל שמרי שני היברידיות, להציג הפאג, cross-linking הכימי, Co-IP, טנדם זיקה טיהור (TAP), וכו '. היה בשימוש כדי לחקור חלבוןחלבון אינטראקציות. כל אחת מהגישות הללו יש סט של נקודות חוזק וחולשה בכל הקשור לרגישות וסגוליות משלו. ביניהם, את שיטת TAP מאפשרת זיהוי של אינטראקציה פיזית בתנאים כמעט פיסיולוגיים, שומרת על ייחוד ועקביות 2 וכוללת את היכולת להרחיב לתפוקה גבוהה ניתוח 3,4.
שיטת TAP פותחה בשמרים במקור על ידי עמיתי Rigautand 1. בשיטה זו, חלבון של העניין בא לידי ביטוי עם תג TAP. תג TAP מטפח שני תחומים עצמאיים מחייב זיקה: חלבון תחום שנקשר לנוגדנים ומחייב רישום calmodulin. שני תחומים מופרדים על ידי אתר מחשוף TEV (וירוס Etch טבק). שילוב כזה מאפשר לשני סיבובים עצמאיים של purifications זיקה כדי להפחית במידה מספקת איגודים ספציפיים ולהעשיר איגודים ספציפיים 1. למשל זה, שיטת TAP היא metho חזק מאודד לזהות באינטראקציות vivo של חלבון נתון, אם כי ביתר את חלבון אקסוגני יכול לעשות את זה יותר נוטה לקשר עם חלבונים שעושים בדרך כלל אינו מורכב עם עמיתו אנדוגני שלה. מאז הפיתוח שלה, שיטת TAP כבר מיושמת במערכות רבות אחרות, כוללים תאים המבוסס על תרבות מערכות 5,6 ובמערכות מודל vivo אחרות 6-9. כאן אנו מתארים את העיבוד של שיטת TAP בדרוזופילה. אנחנו מייצרים ראשון וקטורי pUAST-NTAP וpUAST-CTAP כדי להקל על שיבוט והיתוך של תג TAP לאו N-או C-המסוף של הגן של עניין. -מתויג TAP כטב"מ transgene לאחר מכן בא לידי ביטוי במערכת העצבים בשליטתו של נהג GAL4 עצבי 10. בשלב הבא, מספר גדול של ראשי זבוב בוגרים ייאסף, שבו יש תכולה גבוהה של תאים עצביים וקלים להיפרד מחלקי גוף אחרים לאחר הקפאה המבוסס על הבדלים בגודל. הראשים הבוגרים ב הומוגני ופינהcentrifugations y הרציף, ואת supernatant כפוף להליך TAP המתואר להלן.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת טיהור זיקת טנדם (TAP) מציעה פרוטוקול טיהור כפול המאפשר בידוד והעשרה של קומפלקסי חלבונים באמצעות שני צעדי טיהור זיקה עצמאיים. העיצוב של תג TAP אינו מוגבל למה שמוצג בפרוטוקול זה, תחומים אחרים חלבון מחייב ומוטיבים חלים גם אם תנאי חיץ מותאמים בהתאם. דוגמא טובה לתגי TAP אח…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים EUROSARF ששלח לנו פלסמידים ביטוי השמרים TAP. אנו מודים גם למערכת עזרה מLabadens ריאן. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH / NINDS (R01NS070962) לCW
Materials
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
Referências
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
- Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
- Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
- Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
- Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16 (2007).
- Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
- Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).
- Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
- Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. Shotgun proteomics in neuroscience. Neuron. 63, 12-26 (2009).
