Identificare proteina-proteina interazione in<em> Drosophila</em> Adult capi di Tandem Affinity Purification (TAP)
Summary
Drosophila è famosa per la sua manipolazione genetica potente, ma non per la sua idoneità di analisi biochimica in profondità. Qui vi presentiamo una procedura basata TAP-per identificare interagiscono partner di qualsiasi proteina di interesse da parte del cervello della mosca. Questa procedura può potenzialmente portare a nuove vie di ricerca.
Abstract
Schermi genetici condotti utilizzando Drosophila melanogaster (moscerino della frutta) hanno fatto numerose scoperte pietra miliare nel progresso delle scienze biologiche. Tuttavia, l'uso di schermi biochimiche finalizzate ad estendere le conoscenze acquisite da analisi genetica è stata esplorata solo di recente. Qui si descrive un metodo per purificare il complesso proteico che si associa con qualsiasi proteina di interesse da teste di mosca adulta. Questo metodo sfrutta il sistema Drosophila GAL4/UAS per esprimere una proteina esca fuso con un Tandem Affinity Purification (TAP) tag in neuroni di topo in vivo e quindi implementa due cicli di purificazione utilizzando una procedura TAP simile a quello inizialmente stabilito in lievito 1 per purificare il complesso proteina interagente. Al termine di questa procedura, una miscela di diversi complessi proteici si ottiene la cui identità molecolare può essere determinato mediante spettrometria di massa. Validazione delle proteine candidati beneficeranno del reSource e facilità di esecuzione di perdita-di-funzione studi di mosche. Approcci simili possono essere applicati ad altri tessuti mosca. Crediamo che la combinazione di manipolazioni genetiche e questo approccio proteomico nel sistema modello fly detiene un enorme potenziale per affrontare i problemi fondamentali nel campo della neurobiologia e oltre.
Introduction
Definizione dei meccanismi molecolari o reti che mediano un particolare processo biologico è uno degli obiettivi finali della ricerca biomedica. Fly genetisti hanno dipendeva pesantemente sulla genetica in avanti, soprattutto modificatore schermi genetici (sia enhancer e schermi soppressori), per identificare i fattori che lavorano insieme, in parallelo, o monte oa valle di un gene di interesse. Tuttavia, gli schermi genetica in avanti spesso non riescono a identificare i geni essenziali che, se mutato, causa letalità nelle fasi precoci dello sviluppo, oi geni con ridondanza funzionale e compensazione la cui perdita di funzione solo causare difetti sottili che sono difficili da segnare. Un modo per superare questa difficoltà è quello di schermo per interazioni dirette proteina-proteina. Per più di un decennio, un crescente elenco di metodi biochimici, tra cui due ibridi di lievito, esposizione su fago, reticolazione chimica, Co-IP, Tandem Affinity Purification (TAP), etc. sono stati utilizzati per studiare proteine-proteina interazioni. Ognuno di questi approcci ha una propria serie di punti di forza e di debolezza in materia di sensibilità e specificità. Tra questi, il metodo TAP consente il rilevamento di interazione fisica in condizioni quasi fisiologiche, conserva specificità e consistenza 2 e include la possibilità di estendere a high-throughput analisi 3,4.
Il metodo TAP è stato originariamente sviluppato nel lievito da colleghi Rigautand 1. In questo metodo, una proteina di interesse è espressa con un tag TAP. Il tag TAP ospita due affinità di legame domini indipendenti: una proteina Un dominio che si lega a IgG e un dominio-calmodulina vincolante. I due domini sono separati da una TEV (Tobacco Etch Virus) sito di clivaggio. Tale combinazione permette per due turni indipendenti di purificazioni affinità per ridurre sufficientemente le associazioni aspecifici e arricchiscono le associazioni specifiche 1. Per questo esempio, il metodo TAP è un potente metodologiad identificare interazioni in vivo di una data proteina, sebbene sovraesprimono la proteina esogena può rendere più inclini ad associare proteine che normalmente non complesso con la sua controparte endogena. Dal suo sviluppo, il metodo TAP è stato applicato in molti altri sistemi, inclusi-coltura a base di cellule sistemi 5,6 e altri sistemi modello in vivo 6-9. Qui si descrive l'adattamento del metodo TAP in Drosophila. Per prima cosa generiamo pUAST-NTAP e pUAST-CTAP vettori per facilitare la clonazione e la fusione del tag TAP sia alla N-o C-terminale del gene di interesse. Il UAS-TAP-tag transgene viene poi espressa nel sistema nervoso sotto il controllo di un driver GAL4 neuronale 10. Successivamente, verrà raccolto un gran numero di teste mosca adulta, che hanno un alto contenuto di cellule neurali e sono facili da separare da altre parti del corpo dopo il congelamento sulla base delle differenze di dimensioni. Le teste adulti sono omogeneizzati e liquidati bcentrifugazioni sequenziali y, e il surnatante è soggetto a una procedura di TAP descritta di seguito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodo Tandem purificazione per affinità (TAP) offre un protocollo dual purificazione che permette l'isolamento e l'arricchimento di complessi proteici attraverso due passaggi di purificazione di affinità indipendenti. Il design del tag TAP non è limitata a ciò che viene presentato in questo protocollo, le altre proteine domini di legame e motivi sono applicabili anche se le condizioni del buffer vengono adeguati di conseguenza. Un buon esempio di altri tag TAP è il tag GS-TAP, una combinazione di una…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo EUROSARF per averci inviato il lievito TAP plasmidi di espressione. Siamo anche grati per l'aiuto editoriale da Ryan Labadens. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa NIH / NINDS (R01NS070962) per CW
Materials
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
Referências
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