Определение белок-белковых взаимодействие в<em> Дрозофилы</em> Взрослые Главы по Tandem аффинной очистки (TAP)
Summary
Drosophila славится своей мощной генетической манипуляции, но не для его пригодности углубленного биохимического анализа. Здесь мы представляем процедуру TAP основе для выявления взаимодействующих партнеров любого интересующего белка с лету мозга. Эта процедура может потенциально привести к новым бульварам исследования.
Abstract
Генетические экраны, проведенные с использованием дрозофилы (плодовой мухи) сделали многочисленные вехой открытия в заранее биологических наук. Тем не менее, использование биохимических экранов, направленных на расширение знаний, полученных от генетического анализа была изучена лишь недавно. Здесь мы опишем метод, чтобы очистить белковый комплекс, который ассоциируется с любого интересующего белка от взрослых мух голов. Этот метод использует системы дрозофилы GAL4/UAS выразить приманки белка, слитого с тегом Тандем Affinity Очистка (ТАР) в лету нейронов в естественных условиях, а затем реализует два раунда очистки с использованием процедуры TAP похожий на тот, первоначально закрепленной в дрожжи 1, чтобы очистить взаимодействующих белкового комплекса. В конце этой процедуры, смесь нескольких белковых комплексов получается, молекулярная идентичность может быть определена путем масс-спектрометрии. Проверка кандидата белков выиграют от гesource и простота выполнения с потерей функции исследования в мух. Аналогичные подходы могут быть применены к другим мухи тканей. Мы считаем, что сочетание генетических манипуляций и этого протеомного подхода в лету модельной системы имеет огромный потенциал для решения фундаментальных проблем в области нейробиологии и за ее пределами.
Introduction
Определение молекулярных путей и сетей, которые опосредуют особую биологический процесс является одним из конечных целей биомедицинских исследований. Fly генетики значительной степени зависят от форвардных генетики, особенно модификатора генетические экраны (как энхансерные и экраны супрессоры), выявить факторы, которые работают вместе, параллельно с или до или после интересующего гена. Тем не менее, вперед генетика экраны зачастую не в состоянии идентифицировать существенные гены, которые, когда мутировал, вызвать летальность на ранних стадиях развития, или гены с функциональной избыточности и компенсации которого потеря функции только вызывают тонкие дефекты, которые трудно забить. Одним из способов преодоления этой трудности является для выявления прямых белок-белковых взаимодействий. На протяжении более чем десяти лет, растущий список биохимическими методами, в том числе дрожжей двухгибридной фагов, химической сшивки, со-IP, Tandem аффинной очистки (TAP) и др. были использованы для исследования белок-белковых взаимодействий. Каждый из этих подходов имеет свой собственный набор сильных и слабых сторон в отношении чувствительности и специфичности. Среди них, метод TAP позволяет для обнаружения физического взаимодействия в ближней физиологических условиях, сохраняет специфику и последовательности 2 и включает в себя возможность расширения до высокой пропускной анализирует 3,4.
Метод TAP был первоначально разработан в дрожжах путем Rigautand коллегами 1. В этом методе, представляющий интерес белок экспрессируется с краном тега. TAP тег таит два независимых сродством-связывающие домены: белок доменов, который связывается с IgG и калмодулин-связывающий домен. Две области отделены друг от друга TEV (табак) травления Вирус сайта расщепления. Такое сочетание позволяет два независимых раунда сродства очисток, чтобы значительно уменьшить неспецифические привязки и обогатить конкретных привязок 1. Для этого, например, метод ТАР является очень мощным метод определить в естественных условиях взаимодействия данного белка, хотя гиперэкспрессией экзогенного белка может сделать его более склонны связывать с белками, которые обычно не комплекс с эндогенным коллегой. С момента своего развития, метод ТАР был применен во многих других системах, в том числе клеточных культур на основе систем 5,6 и других в естественных условиях модельных систем 6-9. Здесь мы опишем адаптации метода TAP у дрозофилы. Сначала генерировать pUAST-NTAP и pUAST-CTAP векторы для облегчения клонирования и слияние ТАР тега или к N-или C-конце гена. UAS-TAP-меченый трансген затем выразили в нервной системе под контролем нейронов водителя GAL4 10. Далее, большое количество взрослых мух головок будут собраны, которые имеют высокое содержание нервных клеток и их легко отделить от других частей тела после замораживания на основе различия в размерах. Взрослые руководители гомогенизируют и очистили бу последовательные центрифугирования и супернатант подлежит процедуре TAP, описанным ниже.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод Тандем аффинной очистки (ТАР) предлагает двойной протокол очистки, который позволяет выделение и обогащение белковых комплексов через два независимых стадий очистки близость. Конструкция TAP тега не ограничивается тем, что представлено в данном протоколе, других белковых связыв?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим EUROSARF для отправки нам дрожжи TAP плазмиды экспрессии. Мы также благодарны за редакционной помощи Райан Labadens. Эта работа была поддержана грантом NIH / NINDS (R01NS070962) к CW
Materials
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
Referências
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
- Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
- Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
- Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
- Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16 (2007).
- Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
- Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).
- Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
- Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. Shotgun proteomics in neuroscience. Neuron. 63, 12-26 (2009).
