La vasocostrizione polmonare ipossica (HPV) è un importante fenomeno fisiologico con cui alla perfusione polmonare ipossia alveolare viene abbinata alla ventilazione. Il principale segmento vascolare che contribuisce all’HPV è l’arteria intra-acinare. Qui descriviamo il nostro protocollo per l’analisi dell’HPV dei vasi polmonari murini con diametri di 20-100 μm.
L’ipossia alveolare acuta causa vasocostrizione polmonare (HPV) – nota anche come meccanismo von Euler-Liljestrand – che serve ad abbinare la perfusione polmonare alla ventilazione. Finora, i meccanismi sottostanti non sono pienamente compresi. Il principale segmento vascolare che contribuisce all’HPV è l’arteria intra-acinare. Questa sezione del vaso è responsabile dell’apporto di sangue di un singolo acino, che è definito come la porzione di distale polmonare a un bronchiolo terminale. Le arterie intra-acinari si trovano principalmente in quella parte del polmone che non può essere raggiunta selettivamente da una serie di tecniche comunemente utilizzate come la misurazione della pressione arteria polmonare in polmoni perfusi isolati o registrazioni di forza da segmenti di arteria polmonare prossimale sezionati1,2. L’analisi dei vasi subpleurali mediante microscopia a scansione laser confocale in tempo reale è limitata a recipienti con un diametro fino a 50 μm3.
Forniamo una tecnica per studiare l’HPV delle arterie intrapolmonari murine nell’intervallo di diametri interni di 20-100 μm. Si basa sull’analisi videomorfometrica delle arterie sezionate incrociate in fette polmonari tagliate di precisione (PCLS). Questo metodo consente la misurazione quantitativa della vasoreattività di piccole arterie intra-acinari con diametro interno compreso tra 20-40 μm che si trovano a soffici di setti alveolari accanto a condotti alveolari e di arterie preacinari più grandi con diametri interni tra 40-100 μm che corrono adiacenti a bronchi e bronchiole. A differenza dell’imaging in tempo reale dei vasi subpleurali nei topi anestetizzati e ventilati, l’analisi videomorfometrica del PCLS avviene in condizioni libere da sollecitazioni di taglio. Nel nostro modello sperimentale entrambi i segmenti arteriosi presentano un HPV monofasico quando esposti a gas medi con 1% O2 e la risposta svanisce dopo 30-40 minuti all’ipossia.
Nella maggior parte dei letti vascolari sistemici l’ipossia induce vasodilatazione, rispetto alla vasocostrizione causata dall’ipossia nella vascuola polmonare. Questa risposta specifica del polmone alla tensione dell’ossigeno abbassata è chiamata vasocostrizione polmonare ipossica (HPV), si insedia in pochi secondi e si inverte rapidamente dopo il ritorno alla ventilazione normossica. Sebbene l’HPV sia noto da più di 60 anni, i sensori di ossigeno cellulare e le cascate di segnalazione che hanno portato alla vasocostrizione sono ancora in discussione. C’è un ampio consenso sul fatto che i cambiamenti redox e ROS evocati dall’ipossia sono essenziali per l’HPV e lo sviluppo dell’ipertensione polmonare (recensita in Sylvester et al. 4 e Schumacker et al. 5). I nostri dati supportano un ruolo centrale del complesso II della catena respiratoria mitocondriale in HPV6,7. Recentemente, Wang et al. presentato un concetto completamente nuovo per il rilevamento dell’ossigeno e HPV: Sulla base dei loro dati propongono che l’ipossia alveolare sia percepita dai capillari adiacenti causando la depolarizzazione della membrana delle cellule endoteliali. La risposta viene propagata tramite connexion 40 giunzioni gap delle cellule endoteliali che portano alla costrizione delle cellule muscolari lisce delle arteriole a monte8.
Le arterie del polmone corrono lungo le vie aeree, si ramificano con loro, diminuiscono continuamente di diametro e infine forniscono sangue al sistema capillare situato nelle pareti alveolari. Questa circolazione arteriosa è composta da segmenti anatomicamente e funzionalmente distinti. Le arterie del condotto prossimale, caratterizzate da un’abbondanza di fibre elastiche nelle pareti, sono seguite da arterie intrapolmonari completamente muscolose che controllano in gran parte la resistenza vascolare polmonare. Passo dopo passo, queste arterie transitano in segmenti in cui lo strato muscolare diventa incompleto, e infine i vasi sono liberi da cellule actina-immunoreattive muscolari lisce. L’arteria intra-acinare che alimenta un singolo acino polmonare con sangue rappresenta un segmento parzialmente muscolare6. Allo stesso modo, il sistema arterioso polmonare non rappresenta una struttura uniforme per quanto riguarda la risposta ipossica, ma mostra una marcata diversitàregionale 9,10. Ad esempio, nelle arterie polmonari prossimali isolate dai polmoni del ratto l’ipossia induce una risposta bifasica, mostrando una contrazione rapida iniziale di breve durata che – dopo un rilassamento incompleto – è seguita da una seconda contrazione lenta masostenuta 11. Nelle arterie di resistenza isolate dal parenchima polmonare del ratto come quarta e quinta divisione delle arterie polmonari (diametro esterno <300 μm), l'ipossia causa costrizione monofasica9. Già nel 1971 Glazier e Murray conclusero dalle misurazioni dei cambiamenti nella concentrazione capillare di globuli rossi nei polmoni dei cani ventilati con miscele di gas ipossia che l’aumento indotto dall’ipossia nella resistenza vascolare si è verificato principalmente a monte dei capillari12. Al giorno d’oggi, la microscopia intravitale di polmoni intatti di topi anestetizzati e ventilati meccanicamente rappresenta un potente strumento per l’analisi della microvascolarepolmonare 13,14. L’escissione di una finestra circolare nella parete toracica dà accesso microscopico alla superficie del polmone e consente l’analisi di vasi polmonari subpleurali con un diametro fino a 50 μm. Combinando questa tecnica con l’infusione di FITC-dextran, Tabuchi et al. dimostrato che solo arteriole di medie dimensioni con diametri di 30-50 μm mostrano una marcata risposta all’ipossia che ha sostenuto per un periodo di 60 minuti con una lieve attenuazione dopo 30 minuti. Al contrario, piccole arteriole con diametri di 20-30 μm hanno mostrato solo una risposta minore all’ipossia3. Tuttavia, questa tecnica non consente l’analisi di arterie con diametro maggiore di 50 μm poiché questi vasi si trovano troppo in profondità nel tessuto polmonare.
Al fine di colmare il divario nell’analisi di arterie polmonari grandi e molto piccole (come i vasi subpleurali) dei polmoni murini, abbiamo adottato un metodo che è stato descritto da Martin et al. per l’analisi della reattività delle vie aeree15. Basato su una tecnica di instillazione del gel di agarosio, facilita la preparazione di fette polmonari tagliate di precisione (PCLS) da questo organo relativamente morbido ed elastico. All’interno del PCLS la vasoreattività delle arterie sesate incrociate con diametro interno compreso tra 20-100 μm può essere osservata direttamente mediante videomicroscopia. L’applicazione di farmaci durante l’incubazione ipossica del PCLS consente l’analisi dei loro effetti sull’HPV. È di particolare importanza che questa tecnica possa essere applicata anche al topo geneticamente modificato. In base alla loro posizione all’interno del polmone, classifichiamo le arterie come vasi pre e intra-acinari, con diametri interni rispettivamente di 20-40 μm e 40-100 μm. Sotto una visione funzionale l’arteria intra-acinare fornisce un singolo acino polmonare con sangue e l’arteria pre-acinare sono le sezioni precedenti del vaso. La registrazione di immagini su una fotocamera digitale consente la successiva quantificazione della vasoreazione. Un attributo ovvio di questo modello PCLS è la mancanza di sollecitazione di taglio che agisce sull’endotelio. Al contrario, nei recipienti perfusi l’HPV acuto porta ad un aumento dello stress da taglio, inducendo così meccanismi secondari come il rilascio di NO16. Inoltre, l’uso del PCLS consente misurazioni di HPV senza influenze neurali o ormonali extrapolmonari. A differenza dei sistemi di coltura cellulare, ad esempio preparati da cellule muscolari lisce arteriose polmonari canine17, l’architettura istologica della parete del vaso è quasi completamente preservata.
In sintesi, questo protocollo fornisce un metodo utile per l’analisi di potenziali sensori molecolari di ossigeno e/o vie cellulari responsabili dell’HPV delle arterie intrapolmonari con diametri interni tra 20-100 μm in condizioni libere da sollecitazioni di taglio.
Il polmone di topo isolato ventilato e perfuso è un ottimo modello per l’analisi della risposta fisiologica del sistema vascolare polmonare sui cambiamenti nell’apporto di ossigeno e consente, tra l’altro, la misurazione continua della pressione arteriosa polmonare1. Tuttavia, questo modello non consente l’identificazione e l’analisi di quei segmenti vascolari che mostrano la risposta più forte all’ipossia. Questo è il vantaggio della nostra analisi videomorfometrica di PCLS che facilita la misurazione dell’HPV delle singole arterie con diametri interni di 20-100 μm. A differenza dei sistemi di coltura cellulare, tutti i tipi di cellule sono presenti nella loro configurazione originale della matrice tissutale. Inoltre, un polmone è sufficiente per la preparazione di molti PCLS, in modo che almeno parzialmente gli esperimenti possano essere standardizzati con l’uso di sezioni dello stesso mouse. Secondo il concetto 3R (riduzione, affinamento e sostituzione degli animali da laboratorio nelle scienze della vita) di Russell e Burch23 questo fatto sostiene anche l’uso del PCLS.
Tuttavia, bisogna tenere a mente che il tessuto è danneggiato tagliando con un vibratoma e una segnalazione longitudinale, ad esempio attraverso le cellule endoteliali come postulato da Kübler et al. 14 non è più possibile.
Inizialmente, i PCLS sono stati applicati principalmente per studi biochimici, farmacologici e tossicologici, ma nel frattempo sono utilizzati anche per la misurazione della contrattilità bronchiale, della funzione mucociliare e delle risposte vascolari (per le recensioni vedi Sanderson20 e Davies21). Held et al. hanno effettuato uno studio in cui hanno confrontato i modelli di polmone di topo isolato perfuso e ventilato e di PCLS24. Dall’analisi delle risposte delle vie aeree e dei vasi polmonari a una varietà di mediatori endogeni hanno scoperto che importanti caratteristiche dell’intero polmone sono state mantenute nel PCLS.
Nel PCLS, le condizioni ipossiche non sono stabilite attraverso le vie aeree come nel polmone intatto ma mediante incubazione della sezione polmonare nel mezzo ipossico-gassato. Abbiamo analizzato la pressione parziale dell’ossigeno (pO2)del mezzo prepartita con 1% O2,5,3% CO2,93,7% N2 e con 21% O2,5,3% CO2, 73,7% N2,rispettivamente, utilizzando un analizzatore di gas ematico. Immediatamente prima di alimentarlo nella camera di perfusione, il pO2 del MEM gassato ipossico era di 40 mmHg e quello del mezzo normossico gassato 160 mmHg6. Nel polmone intatto l’HPV viene indotto quando la pO alveolare2 scende al di sotto di 50 mmHg25, una situazione che può essere ovviamente mimicked per applicazione di mezzo ipossico-gassato. I nostri dati sull’estensione dell’HPV corrispondono bene ai risultati ottenuti con un diverso approccio sperimentale. Yamaguchi et al. hanno applicato polmoni a ratto isolati per esaminare microvessel con diametro di 20-30 μm mediante microscopia a scansione laser confocale in tempo reale accoppiata a una fotocamera ad alta sensibilità con un intensificatore di immagini10. Hanno osservato una riduzione media del diametro di 2,7 μm dopo l’esposizione dei polmoni all’ipossia. Si può calcolare che una riduzione del 20% dell’area luminare mentre la misuriamo nel nostro sistema corrisponde a una diminuzione di circa il 15% del diametro.
Nei nostri esperimenti abbiamo classificato le arterie come vasi pre e intra-acinari, rispettivamente, con diametri interni di 40-100 μm e 20-40 μm. Negli esseri umani la transizione dalle arterie muscolari a non muscolari avviene nell’intervallo di diametro di 70-100 μm. Nei topi, le cellule muscolari lisce sono presenti fino a un diametro esterno di 20 μm26. Per questo motivo non è possibile analizzare le arterie con diametri inferiori a 20 μm poiché non possono essere identificate in modo affidabile in base all’immagine di contrasto di fase. All’altra estremità della scala, i vasi con diametri superiori a 100 μm difficilmente si trovano nel PCLS e comunemente spogliati dal tessuto circostante.
In realtà, un certo numero di candidati molecolari sono discussi come sensori di ossigeno molecolare o come componente della cascata di segnalazione risultante in HPV (per una revisione vedi Sylvester et al. 4). Una volta disponibili topi knockout appropriati, la videomorfometria può essere utilizzata per l’analisi della vasoreattività delle arterie pre e intra-acinari rispetto agli animali di tipo selvatico. Tuttavia, i PCLS sono stati utilizzati anche per altri problemi: Faro et al. li ha impiegati per caratterizzare lo sviluppo della dilatazione dipendente dall’endotelio nelpolmone dopo la nascita 29 e PCLS preparato da cavie esposte al fumo o all’aria ogni giorno per 2 settimane sono stati utilizzati per dimostrare l’impatto del fumo di sigaretta sulla vasoreattività attraverso l’induzione della disfunzione endoteliale30.
Passaggi critici all’interno del protocollo
Nei nostri esperimenti abbiamo classificato le arterie come pre-acinari (diametri interni di 40-100 μm) e intra-acinare (diametri interni di 20-40 μm). Soprattutto per la preparazione di sezioni polmonari che dovrebbero essere utilizzate per l’analisi di vasi più grandi è importante aggiungere nitroprusside di sodio al tampone perfusione. Questo farmaco previene la contrazione dei vasi durante la preparazione del campione e quindi la loro fregatura dal tessuto circostante portando a vasodilatazione incompleta. Il nitroprusside di sodio nel tampone perfusione non è così importante per la preparazione della sezione polmonare che dovrebbe essere utilizzata per l’analisi di piccole arterie perché sono fortemente ancorate al setto alveolare.
Tutti gli esperimenti devono essere avviati con incubazioni in cui viene testata la reattività delle arterie. Raramente, abbiamo ottenuto preparati polmonari in cui non era rilevabile alcuna risposta delle navi agli appaltatori o ai dilatatori. Non conosciamo il motivo: potrebbe essere che il volume dell’agarosio riempito nei polmoni era troppo grande o troppo basso in modo che il taglio dell’organo nel PCLS non fosse ottimale. In alternativa, è immaginabile che l’agarosio si sia raffreddato troppo velocemente durante la procedura di instillazione con conseguente dannoso stress da taglio. Nel caso in cui in un singolo PCLS non sia rilevabile alcuna arteria praticabile, la sezione deve essere scartata e sostituita da un’altra.
La decisione sulla fattibilità di un’arteria è stata presa sulla base della risposta all’U46619. L’applicazione di U46619 ad una concentrazione di 0,1 μM induce una vasocostrizione che – dopo qualche esercizio – è visibile direttamente nella sequenza di immagini sullo schermo. Poiché ci sono alcune variazioni nella vasoreattività, studiamo l’impatto di un farmaco sull’HPV misurando la vasoriscrizione in sezioni polmonari esposte al farmaco o al solo mezzo a turno.
L’HPV di una singola arteria è spesso difficilmente rilevabile al microscopio e in media si traduce in una riduzione dell’area luminare di circa il 20-30%. Tuttavia, piccoli cambiamenti nel diametro di un’arteria hanno un input distinto sulla resistenza al flusso. Secondo l’equazione “R = 1/r4” con R=resistenza e r=raggio, la resistenza al flusso è inversamente proporzionale alla quarta potenza del raggio. Faccio un esempio: un’arteria “ideale” che mostra una sezione trasversale circolare con un diametro di 40 μm (r =20 μm) ha un’area luminare di circa 1.260 μm2. Quando l’area luminare viene ridotta del 20%, possiamo calcolare che il diametro del vaso è ridotto del 10,5% a 35,8 μm (r = 17,9 μm). Secondo l’equazione sopra fornita, la resistenza al flusso di questo vaso aumenterebbe da 6,25 x 10-6 a 9,71 x 10-6 che è di circa il 55%. In caso di riduzione dell’area luminare del 30% il raggio diminuirebbe di circa il 16%, ma la resistenza al flusso aumenterebbe di circa il 100%. Sebbene questi calcoli siano una semplificazione eccessiva in cui si presume un flusso sanguigno laminare e una forma vaso di un tubo rigido, è suggestivo dell’impatto di cambiamenti già minori del diametro sulla resistenza al flusso.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è sponsorizzata dall’Excellence Cluster Cardio-Pulmonary System.
Vibratome "Microm HM 650 V" | Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Microwave oven | Bosch, Frankfurt, Germany | HMT 702C | |
Heating cabinet | Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Flow-through superfusion chamber | Hugo Sachs Elektronik, March, Germany | PCLS-Bath Type: 847 SN:4017 | |
Upright inverted microscope equipped with 4X, 10X, 20X, and 40X objectives | Leica, Wetzlar, Germany | ||
CCD-camera | Stemmer Imaging, Puchheim, Germany | ||
Peristaltic pump Minipuls 3 | Gilson, Limburg-Offheim, Germany | ||
Water bath “Universal Wasserbad Isotem 205” | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 9452450 | |
Gas tight tubes Tygon R3603-13 Øi: 3/32 in, Øa: 5/32 in, wall: 1/32 in | VWR, Darmstadt, Germany | ||
Various scissors and forceps | |||
Sewing cotton | |||
2 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
50 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
Flexible plastic pipe of an IV indwelling cannula “IntrocanR-W” (cannula 20 G x 1 ¼ in, 1.1 x 32 mm) | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4254112B | For instillation of the agarose into the lung |
Cannula 21 G x 4 ¾ in; 0.8 x 120 mm | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4665643 | For bubbling of the medium |
Cannula Nr. 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 mm | Terumo, Eschborn, Germany | NN 2425 88DSF18 | For lung perfusion |
Normoxic gas mixture (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
Hypoxic gas mixture (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
HEPES | Sigma, Deisenhofen, Germany | H 4034 | |
NaCl | Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.1 | |
KCl | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04936.0500 | |
MgCl2•6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.05833.0250 | |
CaCl2•2H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.02382.0500 | |
Glucose D-(+) | Sigma, Deisenhofen, Germany | G 7021 | |
Low melting point agarose | Bio-Rad, Munich, Germany | 161-3111 | |
Heparin-sodium | Ratiopharm, Ulm, Germany | 5120046 | |
Phenolred-free minimal essential medium (MEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 5120046 | |
70% EtOH for desinfection | Stockmeier Chemie, Dillenburg, Germany | ||
Superglue | UHU, Bühl/Baden, Germany or from a supermarket | ||
U46619 (a thromboxane analog) | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 538944 | |
Sodium nitroprusside (Nipruss) | Schwarz Pharma, Monheim, Germany | 5332804 | |
Optimas 6.5 software | Stemmer, Puchheim, Germany | ||
SPSS 19 | AskNet, Karlsruhe, Germany |