La vasoconstriction pulmonaire hypoxique (HPV) est un phénomène physiologique important par lequel à l’hypoxie alvéolaire la perfusion pulmonaire est assortie à la ventilation. Le segment vasculaire principal contribuant au VPH est l’artère intra-acinnaire. Ici, nous décrivons notre protocole pour l’analyse du VPH des vaisseaux pulmonaires murins d’un diamètre de 20 à 100 μm.
L’hypoxie alvéolaire aiguë provoque une vasoconstriction pulmonaire (VPH) – également connue sous le nom de mécanisme de von Euler-Liljestrand – qui sert à faire correspondre la perfusion pulmonaire à la ventilation. Jusqu’à présent, les mécanismes sous-jacents ne sont pas entièrement compris. Le segment vasculaire principal contribuant au VPH est l’artère intra-acinnaire. Cette section des vaisseaux est responsable de l’approvisionnement en sang d’un acinus individuel, qui est défini comme la partie du poumon distale à une bronchiole terminale. Les artères intra-acinaire sont principalement situées dans la partie du poumon qui ne peut pas être atteinte sélectivement par un certain nombre de techniques couramment utilisées telles que la mesure de la pression artérielle pulmonaire dans des poumons perfusés isolés ou des enregistrements de force à partir de segments d’artère pulmonaire proximaux disséqués1,2. L’analyse des vaisseaux sous-pléuraux par microscopie à luminescence confocale à balayage laser en temps réel est limitée aux vaisseaux ayant jusqu’à 50 μm de diamètre3.
Nous fournissons une technique pour étudier le VPH des artères intra-pulmonaires murines de l’ordre de 20 à 100 μm de diamètre intérieur. Il est basé sur l’analyse vidéomorphométrique des artères transversales en tranches pulmonaires coupées avec précision (PCLS). Cette méthode permet la mesure quantitative de la vasoreactivité de petites artères intra-acinaires d’un diamètre intérieur compris entre 20 et 40 μm qui sont situées à des goussets de septa alvéolaires à côté de conduits alvéolaires et d’artères pré-acinaires plus grandes de diamètre intérieur compris entre 40 et 100 μm qui courent à côté des bronches et des bronchioles. Contrairement à l’imagerie en temps réel des vaisseaux sous-phénolaires chez les souris anesthésiées et ventilées, l’analyse vidéomorphométrique de PCLS se produit dans des conditions exemptes d’effort de cisaillement. Dans notre modèle expérimental les deux segments artériels montrent un HPV monophasique une fois exposés au milieu gazé avec 1% O2 et la réponse s’estompe après la minute 30-40 à l’hypoxie.
Dans la plupart des lits vasculaires systémiques, l’hypoxie induit une vasodilatation, en comparaison de la vasoconstriction causée par l’hypoxie dans la vascularisation pulmonaire. Cette réponse spécifique aux poumons à la baisse de la tension de l’oxygène est appelée vasoconstriction pulmonaire hypoxique (VPH), qui se manifeste en quelques secondes et s’inverse rapidement après le retour à la ventilation normoxique. Bien que le VPH soit connu depuis plus de 60 ans, les capteurs cellulaires d’oxygène et les cascades de signalisation entraînant une vasoconstriction font toujours l’objet de débats. Il existe un consensus relativement large selon lequel les changements redox et ROS évoqués par l’hypoxie sont essentiels pour le VPH et le développement de l’hypertension pulmonaire (examinés dans Sylvester et coll. 4 et Schumacker et al. 5). Nos propres données soutiennent un rôle central du complexe II de la chaîne respiratoire mitochondriale dans HPV6,7. Récemment, Wang et al. a présenté un concept complètement nouveau pour la détection de l’oxygène et le HPV: Sur la base de leurs données, ils proposent que l’hypoxie alvéolaire soit détectée par les capillaires adjacents provoquant la dépolarisation membranaire des cellules endothéliales. La réponse se propage via la connexion 40 jonctions intersitaires des cellules endothéliales conduisant à la constriction des cellules musculaires lisses des artérioles amont8.
Les artères du poumon longent les voies respiratoires, se ramifient avec elles, diminuent continuellement de diamètre et fournissent enfin du sang au système capillaire situé dans les parois alvéolaires. Cette circulation artérielle est composée de segments anatomiquement et fonctionnellement distincts. Les artères proximales de conduit, caractérisées par une abondance de fibres élastiques dans les murs, sont suivies des artères intra-pulmonaires entièrement musclées qui commandent en grande partie la résistance vasculaire pulmonaire. Étape par étape, ces artères transitent en segments où la couche musculaire devient incomplète, et enfin les vaisseaux sont exempts de cellules actine-immunoréactives de muscle lisse. L’artère intra-acinaire alimentant un acinus pulmonaire individuel avec du sang représente un segment partiellement musculaire6. De même, le système artériel pulmonaire ne représente pas une structure uniforme concernant la réponse hypoxique mais présente une diversité régionale marquée9,10. Par exemple, dans les artères pulmonaires proximales isolées des poumons du rat, l’hypoxie induit une réponse biphasique, présentant une contraction initiale rapide de courte durée qui – après relaxation incomplète – est suivie d’une seconde contraction lente mais soutenue11. Dans les artères de résistance isolées du parenchyme pulmonaire du rat en tant que quatrième et cinquième divisions des artères pulmonaires (diamètre extérieur <300 μm), l’hypoxie provoque une constriction monophasique9. Déjà en 1971, Glazier et Murray ont conclu à partir de mesures des changements dans la concentration en globules rouges capillaires dans les poumons de chiens ventilés avec des mélanges de gaz hypoxiques que l’augmentation induite par l’hypoxie de la résistance vasculaire s’est principalement produite en amont des capillaires12. De nos jours, la microscopie intravitale des poumons intacts de souris anesthésiées et ventilées mécaniquement représente un outil puissant pour l’analyse de la microvasculature pulmonaire13,14. L’excision d’une fenêtre circulaire dans la paroi thoracique donne un accès microscopique à la surface du poumon et permet l’analyse des vaisseaux pulmonaires sous-pléuraux de diamètre allant jusqu’à 50 μm. En combinant cette technique avec l’infusion de FITC-dextrane, Tabuchi et al. a démontré que seules les artérioles de taille moyenne d’un diamètre de 30 à 50 μm présentent une réponse marquée à l’hypoxie qui s’est maintenue sur une période de 60 minutes avec une atténuation mineure après 30 minutes. En revanche, les petites artérioles d’un diamètre de 20 à 30 μm ne présentaient qu’une réponse mineure à l’hypoxie3. Cependant, cette technique ne permet pas l’analyse d’artères d’un diamètre supérieur à 50 μm puisque ces vaisseaux sont situés trop profondément dans le tissu pulmonaire.
Afin de combler l’écart dans l’analyse des grandes et très petites artères pulmonaires (telles que les vaisseaux sous-plérurales) des poumons murins, nous avons adopté une méthode qui a été décrite par Martin et al. pour l’analyse de la réactivité des voies respiratoires15. Basé sur une technique d’instillation de gel d’agarose, il facilite la préparation de tranches pulmonaires coupées avec précision (PCLS) à partir de cet organe relativement doux et élastique. Dans le PCLS, la vasoreactivité des artères en coupe transversale d’un diamètre intérieur compris entre 20 et 100 μm peut être observée directement par vidéomicroscopie. L’application de médicaments lors de l’incubation hypoxique du PCLS permet l’analyse de leurs effets sur le VPH. Il est particulièrement important que cette technique puisse également être appliquée aux souris génétiquement modifiées. En fonction de leur emplacement dans le poumon, nous classons les artères comme des vaisseaux pré- et intra-acinaires, avec des diamètres intérieurs de 20-40 μm et 40-100 μm, respectivement. Sous une vue fonctionnelle l’artère intra-acinaire fournit à un acinus pulmonaire individuel avec le sang et l’artère pré-acinaire est les sections précédentes de navire. L’enregistrement d’images sur un appareil photo numérique permet la quantification ultérieure de la vasoreaction. Un attribut évident de ce modèle PCLS est l’absence de cisaillement-stress agissant sur l’endothélium. En revanche, dans les vaisseaux perfusés, le VPH aigu conduit à une augmentation du stress de cisaillement induisant ainsi des mécanismes secondaires tels que la libération de NO16. De plus, l’utilisation du PCLS permet de mesurer le VPH sans influences neuronales ou hormonales extrapulmonaires. Contrairement aux systèmes de culture cellulaire, par exemple préparés à partir de cellules musculaires lisses artérielles pulmonaires canines17,l’architecture histologique de la paroi des vaisseaux est presque entièrement préservée.
En résumé, ce protocole fournit une méthode utile pour l’analyse des capteurs moléculaires potentiels d’oxygène et/ou des voies cellulaires responsables du VPH des artères intra-pulmonaires dont les diamètres intérieurs se sont compris entre 20 et 100 μm dans des conditions exemptes de contrainte de cisaillement.
Le poumon de souris isolé ventilé et perfusé est un excellent modèle pour l’analyse de la réponse physiologique du système vasculaire pulmonaire sur les changements d’apport en oxygène et permet entre autres la mesure continue de la pression artérielle pulmonaire1. Cependant, ce modèle ne permet pas l’identification et l’analyse de ces segments vasculaires montrant la réponse la plus forte à l’hypoxie. C’est l’avantage de notre analyse vidéomorphométrique du PCLS qui facilite la mesure du VPH d’artères individuelles avec des diamètres intérieurs de 20-100 μm. Les PCLS représentent un modèle in vitro attrayant car ils ressemblent étroitement à l’organe à partir duquel ils sont préparés. Contrairement aux systèmes de culture cellulaire, tous les types de cellules sont présents dans leur configuration tissu-matrice d’origine. En outre, un poumon suffit pour la préparation de nombreux PCLS, de sorte qu’au moins partiellement les expériences peuvent être normalisées par l’utilisation de sections de la même souris. Selon le concept 3R (réduction, raffinement et remplacement des animaux de laboratoire dans les sciences de la vie) de Russell et Burch23, ce fait plaide également en faveur de l’utilisation de PCLS.
Cependant, il faut garder à l’esprit, que le tissu est endommagé par la coupe avec un vibratome et la signalisation longitudinale par exemple via les cellules endothéliales comme postulé par Kübler et al. 14 n’est plus possible.
Initialement, les PCLS ont été principalement appliqués pour des études biochimiques, pharmacologiques et toxicologiques, mais en attendant, ils sont également utilisés pour mesurer la contractilité bronchique, la fonction mucociliaire et les réponses vasculaires (pour les examens, voir Sanderson20 et Davies21). Held et al. ont réalisé une étude dans laquelle ils ont comparé les modèles de poumon de souris perfusé et ventilé isolé et de PCLS24. Ils ont constaté par analyse des réponses des voies aériennes et des vaisseaux pulmonaires à une série de médiateurs endogènes que des caractéristiques importantes du poumon entier ont été maintenues dans PCLS.
Dans PCLS, les conditions hypoxiques ne sont pas établies par l’intermédiaire des voies respiratoires comme dans le poumon intact mais par incubation de la section pulmonaire dans le milieu hypoxique-gazé. Nous avons analysé la pression partielle d’oxygène(pO2)du milieu prégazé avec 1%O2,5,3%CO2,93,7% N2 et avec 21%O2, 5,3%CO2,73,7%N2,respectivement, à l’aide d’un analyseur de gaz sanguin. Immédiatement avant de l’alimenter dans la chambre de perfusion, lepO2 du MEM gazé hypoxique était de 40 mmHg et celui du milieu gazé normoxique de 160 mmHg6. Dans le poumon intact, le VPH est induit lorsque le pO alvéolaire2 tombe en dessous de 50 mmHg25, une situation qui peut évidemment être imitée par l’application d’un milieu hypoxique gazé. Nos données sur l’étendue du VPH correspondent bien aux résultats obtenus avec une approche expérimentale différente. Yamaguchi et al. ont appliqué des poumons de rat isolés pour examiner des microvaisseaux d’un diamètre de 20-30 μm par microscopie à luminescence à balayage laser confocal en temps réel couplée à une caméra haute sensibilité avec un intensificateur d’image10. Ils ont observé une réduction moyenne du diamètre de 2,7 μm après exposition des poumons à l’hypoxie. On peut calculer qu’une réduction de 20% de la surface luminale telle que nous la mesurons dans notre système correspond à une diminution d’environ 15% du diamètre.
Dans nos expériences, nous avons classé les artères comme des vaisseaux pré- et intra-acinaires, respectivement, avec des diamètres intérieurs de 40-100 μm et 20-40 μm. Chez l’homme, la transition des artères musculaires aux artères non musculaires se produit dans la gamme de diamètre de 70-100 μm. Chez la souris, les cellules musculaires lisses sont présentes jusqu’à un diamètre extérieur de 20 μm26. Pour cette raison, il n’est pas possible d’analyser les artères avec des diamètres inférieurs à 20 μm car elles ne peuvent pas être identifiées de la fiabilité sur la base de l’image de contraste de phase. À l’autre extrémité de l’échelle, les vaisseaux d’un diamètre supérieur à 100 μm sont à peine à trouver dans le PCLS et généralement dépouillés des tissus environnants.
En fait, un certain nombre de candidats moléculaires sont discutés en tant que capteur(s) moléculaire(s) d’oxygène ou en tant que composant de la cascade de signalisation entraînant le VPH (pour une revue, voir Sylvester et al. 4). Une fois que les souris knockout appropriées sont disponibles, la vidéomorphométrie peut être utilisée pour l’analyse de la vasoreactivity des artères pré- et intra-acinaires par rapport aux animaux de type sauvage. Cependant, PCLS ont également été utilisés pour d’autres questions: Faro et al. on les employait pour caractériser le développement de la dilatation dépendante de l’endothélium dans le poumon après la naissance29 et le PCLS préparé à partir de cobayes exposés quotidiennement à la fumée ou à l’air pendant 2 semaines pour démontrer l’impact de la fumée de cigarette sur la vasoreactivity par induction d’un dysfonctionnement endothélial30.
Étapes critiques du protocole
Dans nos expériences, nous avons classé les artères comme pré-acinaires (diamètres intérieurs de 40-100 μm) et intra-acinaires (diamètres intérieurs de 20-40 μm). En particulier pour la préparation des sections pulmonaires qui doivent être utilisées pour l’analyse de vaisseaux plus gros, il est important d’ajouter du nitroprusside de sodium au tampon de perfusion. Ce médicament empêche la contraction des vaisseaux pendant la préparation de l’échantillon et donc leur arrachement du tissu environnant conduisant à une vasodilatation incomplète. Le nitroprusside de sodium dans le tampon de perfusion n’est pas si important pour la préparation de la section pulmonaire qui devrait être utilisée pour l’analyse des petites artères parce qu’elles sont fortement ancrées aux septa alvéolaires.
Toutes les expériences doivent être commencées par des incubations dans lesquelles la réactivité des artères est testée. Rarement, nous avons obtenu des préparations de poumon dans lesquelles aucune réponse des navires aux entrepreneurs ou aux dilatateurs n’était discernable. Nous ne connaissons pas la raison de cela: peut-être que le volume de l’agarose rempli dans les poumons était trop grand ou trop faible de sorte que la coupe de l’organe en PCLS n’était pas optimale. Alternativement, il est imaginable que l’agarose se refroidissait trop vite pendant la procédure d’instillation, ce qui entraînait un stress de cisaillement dommageable. Dans le cas où dans un PCLS individuel aucune artère viable n’est détectable, la section doit être écartée et remplacée par une autre.
La décision sur la viabilité d’une artère a été prise basée sur la réponse à U46619. L’application d’U46619 à une concentration de 0,1 μM induit une vasoconstriction qui – après un certain exercice – est visible directement dans la séquence d’images à l’écran. Puisqu’il y a quelques variances dans la vasoreactivity nous étudions l’impact d’un médicament sur HPV en mesurant la vasoresponse dans les sections pulmonaires exposées au médicament ou au milieu seul à son tour.
Le VPH d’une artère individuelle est souvent à peine détectable au microscope et, en moyenne, il en résulte une réduction de la zone luminale d’environ 20 à 30%. Cependant, de petits changements dans le diamètre d’une artère ont une entrée distincte sur la résistance à l’écoulement. Selon l’équation « R = 1/r4 »avec R=résistance et r=rayon, la résistance d’écoulement est inversement proportionnelle à la quatrième puissance du rayon. Permettez-moi de donner un exemple: Une « artère idéale » présentant une section circulaire d’un diamètre de 40 μm (r = 20 μm) a une surface luminale d’environ 1 260 μm2. Lorsque la surface luminale est réduite de 20%, nous pouvons calculer que le diamètre du vaisseau est réduit de 10,5% à 35,8 μm (r= 17,9 μm). Selon l’équation donnée ci-dessus, la résistance à l’écoulement de ce navire passerait de 6,25 x10 -6 à 9,71 x 10-6 soit environ 55%. En cas de réduction de la surface luminale de 30%, le rayon diminuerait d’environ 16%, mais la résistance à l’écoulement augmenterait d’environ 100%. Bien que ces calculs soient une simplification excessive dans laquelle un flux sanguin laminaire et une forme de vaisseau d’un tuyau rigide sont supposés, il est suggestif de l’impact de changements déjà mineurs du diamètre sur la résistance à l’écoulement.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche est parrainée par le système cardio-pulmonaire Excellence Cluster.
Vibratome "Microm HM 650 V" | Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Microwave oven | Bosch, Frankfurt, Germany | HMT 702C | |
Heating cabinet | Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | ||
Flow-through superfusion chamber | Hugo Sachs Elektronik, March, Germany | PCLS-Bath Type: 847 SN:4017 | |
Upright inverted microscope equipped with 4X, 10X, 20X, and 40X objectives | Leica, Wetzlar, Germany | ||
CCD-camera | Stemmer Imaging, Puchheim, Germany | ||
Peristaltic pump Minipuls 3 | Gilson, Limburg-Offheim, Germany | ||
Water bath “Universal Wasserbad Isotem 205” | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 9452450 | |
Gas tight tubes Tygon R3603-13 Øi: 3/32 in, Øa: 5/32 in, wall: 1/32 in | VWR, Darmstadt, Germany | ||
Various scissors and forceps | |||
Sewing cotton | |||
2 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
50 ml Syringe | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
Flexible plastic pipe of an IV indwelling cannula “IntrocanR-W” (cannula 20 G x 1 ¼ in, 1.1 x 32 mm) | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4254112B | For instillation of the agarose into the lung |
Cannula 21 G x 4 ¾ in; 0.8 x 120 mm | Braun-Melsungen AG, Melsungen, Germany | 4665643 | For bubbling of the medium |
Cannula Nr. 17, 24 G x 1, 0.55 x 25 mm | Terumo, Eschborn, Germany | NN 2425 88DSF18 | For lung perfusion |
Normoxic gas mixture (21% O2, 5.3% CO2, 73.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
Hypoxic gas mixture (1% O2, 5.3% CO2, 93.7% N2) | Linde, Hildesheim, Germany | ||
HEPES | Sigma, Deisenhofen, Germany | H 4034 | |
NaCl | Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.1 | |
KCl | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04936.0500 | |
MgCl2•6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.05833.0250 | |
CaCl2•2H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1.02382.0500 | |
Glucose D-(+) | Sigma, Deisenhofen, Germany | G 7021 | |
Low melting point agarose | Bio-Rad, Munich, Germany | 161-3111 | |
Heparin-sodium | Ratiopharm, Ulm, Germany | 5120046 | |
Phenolred-free minimal essential medium (MEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 5120046 | |
70% EtOH for desinfection | Stockmeier Chemie, Dillenburg, Germany | ||
Superglue | UHU, Bühl/Baden, Germany or from a supermarket | ||
U46619 (a thromboxane analog) | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 538944 | |
Sodium nitroprusside (Nipruss) | Schwarz Pharma, Monheim, Germany | 5332804 | |
Optimas 6.5 software | Stemmer, Puchheim, Germany | ||
SPSS 19 | AskNet, Karlsruhe, Germany |