세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포
Summary
세균의 생물 발광 유전자 카세트를 표현하는 포유 동물 세포 (<em> 룩스</em>) 자율적으로 빛을 생산하고 있습니다. 화학 물질에의 노출에 따라 결과 발광 역학은이 세포에게 쉽게 높은 처리량 자동화에 적용 할 수있는 저렴하고, 연속, 실시간 독성 검사 도구를 만드는 세포의 성장과 신진 대사에 치료 효과를 반영하기 위해 입증되었습니다.
Abstract
포유류 세포 기반 생체 분석에 널리 독성 연구를위한 동물 실험의 대안으로 채택되었지만 인해 반딧불 루시 페라 기반 검사 방법의 파괴 특성에 필요하게되는 병렬 샘플 준비의 높은 금융 및 시간 비용으로 인해 제한되어있다 . 이 비디오는 그 화합물의 세포 독성 효과를 모니터링하기위한 저렴하고 손쉬운 방법으로, 루시페린 기판의 파괴적인 추가를 필요로하지 않는 자율적으로 발광 포유 동물 세포의 활용을 설명합니다. 안정적 전체 세균의 생물 발광 (luxCDABEfrp) 유전자 카세트를 표현 포유 동물 세포는 자율적으로 광 신호를 생성하는 외부 에너지 원, 또는 전통적 시료의 파괴에 의한 비용과 가능한 간섭 루시페린 기판, 여기의 첨가없이 490 nm에서 피크 광학 이미징 절차 동안 수행의. 외부 자극으로부터이 독립 결과 신호 만 활성화 신진 대사 감지 될 것을 의미, 전적으로 셀 발광 반응을 유지하기위한 부담을 배치합니다. 발광 생산의 변화가 세포의 성장과 신진 대사에 악영향을 나타내는 때문에이 특성은 럭스 발현 세포주 세포 독성 효과에 대한 biosentinel로 사용하기위한 최상의 후보합니다. 마찬가지로, 필요한 샘플 파괴의 자율적 인 성격과 부족은 독성 물질 노출의 기간 동안 실시간으로 동일한 샘플의 반복 이미징을 허용하고 자동화 된 방식으로 기존 영상 장비를 사용하여 여러 샘플을 통해 수행 할 수 있습니다.
Introduction
그들은 식품 의약청 (Food and Drug Administration) 소비자의 사용이 승인되기 전에 미국에서, 인간의 소비를위한 의약품 및 기타 제품은 광범위한 평가를 필요로합니다. 이 테스트를 수행하기위한 재정 부담이 크게 소비자를위한 비용 증가로 새로운 화합물을 개발하기 때문에 번역의 비용을 증가 개발자 1에 배치됩니다. 이 검사 전통적으로 많은 인간의 호스트에 대한 프록시 역할을하는 동물의 과목을 활용했지만,이 (독극물 / ADME 흡착, 분배, 대사, 배설 및 독성에 연간 소요 추정 2,800,000,000달러로, 큰 재정 부담이 될 입증되었습니다 ) 단독 심사 2과 동물 모델을 안정적으로 인간 학적 반응에게 3 예측할 수없는 것을 제안 증거 확보. 따라서 체외 인간의 세포 배양 기반의 테스트 때문에 상대적으로 지난 20 년 동안 인기를 얻고있다비용, 높은 처리량, 그리고 인간의 생체 이용률 및 독성 4의 좋은 표현입니다. 현재 셀 문화 기반의 독성 스크리닝 방법은 세포 생존에게 5을 평가하기 위해, 세포막의 무결성을 프로빙, 또는 미토콘드리아 활동의 수준을 추적, 내생 가능한 세포질 효소의 활동을 심사, 이러한 ATP 수준의 측정 등 다양한 엔드 포인트를, 고용 6. 측정함으로써 단일 시점의 데이터를 생성, 촬영하기 전에 그러나,에 관계없이 선택된 엔드 포인트의이 방법은 모든 시료의 파괴를 필요로합니다. 결과적으로 많은 양의 샘플은 준비 및 기본 독성 동력학 연구를위한 병렬 처리, 다시 새로운 화합물 개발에 필요한 비용과 노동력에 추가해야합니다. 또한, 사용 분석은 Gaussia 루시 페라 제 7 Vargula 루시 페라 제 8 및 Metridia 루시 페라 제 9과 루시 페라 분비세포 용해에 대한 필요성을 제거하고 엔드 포인트 측정을위한 미디어의 일부만을 필요로하지만, 이들은 여전히 일정 시간 지점에서 샘플링을 제한하고 또한 외생 빛을 활성화 기판의 추가를 필요로하는 개발되었습니다.
필요한 샘플 파괴의 손해뿐만 아니라 기판의 비용을 제거하기 위해를 방지하기 위해, 인간의 세포 라인은 비슷합니다 살아있는 세포를 지속적으로 모니터링 할 수 있도록 전체 세균의 생물 발광 (LUX) 유전자 카세트 (luxCDABEfrp) 표현하는 설계되었습니다 형광 염료 기반의 라이브 셀 이미징하지만, 추가 광자 활성화 및 현미경 조사 절차없이. 이 세포주 따라서 시료의 파괴를 방지, 구조적으로 외부 자극에 대한 필요없이 지속적 직접 검출을위한 광 신호를 생성 할 수 있습니다. 기작이 세포에서 생성되는 발광 신호가 발생의 luxAB 구성된 루시 페라 제 효소는 감소 리보플라빈 인산염의 존재 (FRP 유전자에 의해 FMN에서 재활용 FMNH 2의 긴 사슬 지방산 알데히드 (내생 기판을 사용하여 luxCDE 유전자 산물에 의해 합성 및 재생)의 산화를 촉진시 제품)와 산소 분자 10. 숙주 세포에있는 럭스 카세트의 발현 따라서 생산 세포의 파괴 또는 외인성 기판 추가하지 않고 감지 할 빛을 수 있습니다. 마찬가지로, 럭스 유전자와 내생 사용할 수 FMN, 및 O 2 cosubstrates 및 FMNH 2 FMN의 변환을 지원 할 수있는 환경의 정비에 대한 요구 사이의 상호 작용 결과 생물 발광 신호가 단지 생활에서 감지 할 수 있도록 , 대사 활성 셀.
이러한 요구 사항은 이전에 해당 럭스-BAS를 보여 악용되었습니다ED 발광 출력은 세포 인구 크기 11 그 독성 화합물에 노출 용량 – 반응 패션 12 autobioluminescent 생산을 저해와 강하게 연관시킵니다. 여기에서 우리는 독성 테스트를위한 autobioluminescent 포유 동물 세포의 응용 프로그램을 확인하는 대표적인 예로 알려진 DNA 손상 활동 블레오 마이신 계열의 항생제의 자동 독성 스크리닝을 보여 이전에 특징 autobioluminescent 인간의 배아 신장 (HEK293) 세포 라인 (11)을 사용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법은 살아있는 세포가 지속적으로 자신의 일생을 통해 모니터링 할 수 있습니다 체외 독성 스크리닝 검사에서와 같은 자율적으로 발광 포유 동물 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 유연하고 필요에 따라 특정 실험 조건에 맞게 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 실험은 급성 독성을 추적에 적합 여기서 제시하지만, 반복적으로 증가 시간 간격 (예 : 매 24 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이러한 연구 노력은 화학, 생물, 환경, 보너스 번호 CBET-0853780 및 CBET-1159344 및 건강의 국립 연구소, 환경 건강 과학 국립 연구소 (NIEHS)에 따라 전송 (CBET) 시스템의 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부문에 의해 지원되었다 보너스 번호 1R43ES022567-01, 그리고 국립 암 연구소, 보너스 번호 CA127745-01에 따라 암 이미징 프로그램에 따라. 이 연구에서 사용 된 IVIS 루미나 계기는 미국 육군 국방 대학 연구 계측 프로그램에서 얻은 것입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comment |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
Referências
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