תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity
Summary
תאי יונקים המבטאים את קלטת גן פליטת אור (החיידקים<em> לוקס</em>) לייצר אור באופן עצמאי. דינמיקת bioluminescent נובעת בעת החשיפה כימית הוכח כדי לשקף את השפעות הטיפול על גדילה וחילוף חומרים תאיים, מה שהופך את התאים האלה כלי זול, רציף, בזמן אמת רעילות הקרנה שיכול בקלות להיות מותאם לאוטומציה תפוקה גבוהה.
Abstract
תא המבוסס במבחני חוץ גופית יונקים כבר מועסק באופן נרחב כחלופות לניסויים בבעלי החיים למחקרי toxicological אבל היו מוגבל בשל העלויות הכספיות הגבוהות של זמן והכנת מדגם מקביל המתחייבות עקב הטבע ההרסני של שיטות הקרנה מבוססות לוציפראז גחלילית . סרטון זה מתאר את הניצול של תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent, אשר אינם דורש תוספת ההרסנית של מצע luciferin, כשיטת זולה וקלילה לניטור ההשפעות הרעילים של תרכובת של עניין. תאי יונקים ביציבות להביע פליטת אור חיידקים מלאה (luxCDABEfrp) קלטת גן אוטונומי לייצר אותות אופטיים שפסגות ב 490 ננומטר ללא תוספת של מצע יקר ואולי מפריע luciferin, עירור על ידי מקור אנרגיה חיצוני, או הרס של המדגם שהוא באופן מסורתי מבוצע במהלך הליך הדמיה אופטיים. עצמאות זו מגירוי חיצוני מציבה את נטל לשמירה על תגובת bioluminescent אך ורק בתא, כלומר את האות שנוצרה הוא זוהה רק במהלך חילוף חומרים פעילים. מאפיין זה הופך את קו התא מבטא-Lux מועמד מצוין לשימוש כbiosentinel כנגד השפעות רעילות בגלל שינויים בייצור bioluminescent מצביעים על השפעות שליליות על צמיחה וחילוף חומרים תאיים. כמו כן, האופי האוטונומי וחוסר הרס מדגם הנדרש מאפשר הדמיה חוזרת ונשנית של אותו המדגם בזמן אמת לאורך כל תקופת חשיפת toxicant ויכולים להתבצע על פני מספר רב של דגימות ציוד הדמיה קיים בשימוש באופן אוטומטי.
Introduction
בארה"ב, תרופות ומוצרים אחרים המיועדים למאכל אדם דורשים הערכה מקיפה לפני שהם מאושרים לשימוש על ידי הצרכנים מזון והתרופות אמריקניות. נטל הכספי לביצוע בדיקה זו מושם על 1 מפתח, אשר מגביר באופן משמעותי את עלות פיתוח מתחם חדש ולכן מיתרגם התייקרות לצרכנים. אמנם באופן מסורתי הרבה יותר של הקרנה זו מנוצל נושאי בעלי חיים לפעול כשליחים למארחי אדם, זה הוכיח להיות נטל כספי גדול, עם הערכת 2.8 מליארד דולרים בילו מדי שנה על ADME / Tox (ספיחה, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה, ורעילות ) הקרנה לבד 2 וראיות מצטברות המצביעות על כך מודלים של בעלי חיים לא יכולים לחזות מהימן תגובות toxicological אדם 3. לכן, בבדיקת תא מבוססת התרבות אנושית מבחנה צברה פופולריות בשני העשורים האחרונים בשלה נמוך יחסיתעלות, תפוקה גבוהה יותר, וייצוג טוב יותר של זמינות ביולוגית וטוקסיקולוגיה 4 אנושיים. שיטות הקרנה רעילות המבוססות על תרבות התא נוכחית להעסיק נקודות קצה שונות, כגון מדידת רמות ה-ATP, הקרנת הפעילות של אנזימים זמינים cytoplasmic endogenously, חיטוט היושרה של קרום התא, או מעקב אחר רמת הפעילות של המיטוכונדריה, כדי להעריך את הכדאיות סלולרית 5 , 6. עם זאת, ללא קשר לנקודה הסיום שנבחר, שיטות אלו דורשות כל ההרס של המדגם לפני ניתן לקחת מדידות, ובכך לייצר נתונים רק בנקודת זמן אחת. כתוצאה מכך, מספר גדול של דגימות צריכים להיות מוכן ולטפל במקביל ללימודי קינטיקה toxicological בסיסיים, שוב מוסיפים לעלויות והעבודה הנדרשת לפיתוח מתחם החדש. לחלופין, באמצעות מבחני מופרשים לוציפראז כגון Gaussia 7 לוציפראז, Vargula לוציפראז 8, וMetridia לוציפראז 9פותחו שמבטל את הצורך בתמוגה תא ודורש חלק מכלי התקשורת למדידת נקודת סיום, לעומת זאת, אלה עדיין מוגבלים לדגימה בנקודות זמן שנקבעו מראש, וגם דורש תוספת של מצעי אור הפעלה חיצוניים.
כדי להימנע מהפגיעה של הרס מדגם הנדרש, כמו גם לחסל את העלות של מצעים, קו תא אנושי תוכנן המבטא את פליטת אור מלא חיידקים (לוקס) קלטת גן (luxCDABEfrp) כדי לאפשר לניטור רציף של תאי חיים, כי הוא דומה להדמית תא החי המבוססת על ניאון צבע, אך ללא הליכי חקירת פוטון-הפעלה ומיקרוסקופים נוספים. קו תא זה מסוגל לייצר constitutively אות אופטי לגילוי מתמשך, ישיר ללא צורך בגירוי חיצוני, ובכך נמנע הרס של המדגם. מכאני, אות bioluminescent שנוצרה מהתאים אלה לגרוםS כאשר אנזים לוציפראז luxAB-בנוי מזרז החמצון של אלדהיד שומן ארוך שרשרת (מסונתז ונוצר מחדש על ידי שימוש במוצרי גן luxCDE מצעי אנדוגני) בנוכחות המופחת ריבופלאבין פוספט (2 FMNH, שממוחזר מFMN על ידי גן FRP מוצר) וחמצן מולקולרי 10. ביטוי של לוקס הקסטה בתא המארח ולכן מאפשר לאור להיות מיוצר ומזוהה ללא הרס הסלולר או תוספת מצע אקסוגני. בדומה לכך, האינטראקציה בין גנים ולוקס FMN זמין endogenously וcosubstrates O 2, והדרישה לשמירה על סביבה שיכול לתמוך בהמרה של FMN לFMNH 2, מבטיחה שאות bioluminescent כתוצאה מכך יכולה להיות מזוהות רק מהחיים , תאים פעילים מטבולית.
דרישות אלה בעבר נוצלו על מנת להוכיח כי לוקס-basפלט bioluminescent אד קורלציה חזק עם גודל אוכלוסיית הסלולר 11 וכי חשיפת תרכובת רעילה פוגעת בייצור autobioluminescent אופנה מנה תגובה 12. כאן אנו משתמשים בכליות מתאפיינות בעבר autobioluminescent עוברית אנושית (HEK293) שורת תא 11 כדי להדגים את הקרנת טוקסיקולוגי האוטומטית של אנטיביוטיקה מהמשפחה ידועה bleomycin עם פעילות ה-DNA נזק כדוגמה מייצגת כדי לאמת את היישום של תאי יונקים autobioluminescent לבדיקות רעילות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו מדגימה את שימוש בתאי יונקים אוטונומי bioluminescent כבassay הקרנת cytotoxicity המבחנה המאפשר לתאים חיים כדי להיות במעקב רציף לאורך החיים שלהם. פרוטוקול זה הוא גמיש וניתן לשינוי כדי להתאים לתנאי ניסוי ספציפיים כנדרש. לדוגמה, בניסוי שהוצג כאן מתאים למעקב אחר השפעות …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מאמצי המחקר האלה נתמכו על ידי הקרן הלאומית למדע החטיבה כימית, Bioengineering, סביבתי, ותחבורה (CBET) מערכות תחת מספרי הפרס CBET-0,853,780 וCBET-1,159,344 והמכונים הלאומי לבריאות, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה (NIEHS) תחת מספר הפרס 1R43ES022567-01, והמכון הלאומי לסרטן, תכנית הדמיה הסרטן תחת מספר הפרס CA127745-01. מכשיר ומינה IVIS משמש בעבודה זו התקבל מהתכנית של צבא ארצות הברית ביטחון אוניברסיטת מחקר מכשור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comment |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
Referências
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved?. FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441 (2010).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).
