Autonomamente bioluminescenti cellule di mammifero per la continua e monitoraggio in tempo reale di citotossicità
Summary
Cellule di mammifero che esprimono la cassetta genica bioluminescenza batterica (<em> Lux</em>) Produrre luce autonomamente. I conseguenti dinamiche bioluminescenti su di esposizione chimica è stata dimostrata in modo da riflettere gli effetti del trattamento sulla crescita cellulare e il metabolismo, rendendo queste cellule un poco costoso, continua, in tempo reale strumento di screening di tossicità che può essere facilmente adattato per l'automazione ad alta velocità.
Abstract
Cellule di mammifero, con sede in vitro sono stati ampiamente utilizzati come alternative alla sperimentazione animale per gli studi tossicologici, ma sono stati limitati a causa degli elevati costi monetari e di tempo di preparazione del campione parallelo che rese necessarie a causa della natura distruttiva di lucciola luciferasi metodi di screening basati su . Questo video descrive l'utilizzazione di cellule di mammifero autonomamente bioluminescenti, che non richiedono l'aggiunta distruttiva di un substrato luciferina, come un metodo economico e facile per monitorare gli effetti citotossici di un composto di interesse. Cellule di mammifero che esprimono stabilmente la bioluminescenza batterica totale (luxCDABEfrp) cassetta genica autonomamente producono un segnale ottico che picchi a 490 nm senza l'aggiunta di un substrato luciferina costoso e suscettibili d'interferire, eccitazione da una fonte di energia esterna, o la distruzione del campione che è tradizionalmente eseguito durante la procedura di imaging otticos. Questa indipendenza dalla stimolazione esterna pone l'onere per mantenere la reazione di bioluminescenza sulla sola cella, il che significa che il segnale risultante viene rilevato solo durante metabolismo attivo. Questa caratteristica rende la linea cellulare lux esprimono un ottimo candidato per l'uso come un biosentinel contro gli effetti citotossici in quanto i cambiamenti nella produzione bioluminescenti sono indicativi di effetti negativi sulla crescita cellulare e il metabolismo. Analogamente, la natura autonoma e la mancanza di distruzione campionamento richiesto permette ripetuta esposizione dello stesso campione in tempo reale durante il periodo di esposizione tossica e possono essere eseguite su più campioni utilizzando apparecchiatura di immagine esistente in modo automatico.
Introduction
Negli Stati Uniti, i prodotti farmaceutici e di altri prodotti destinati al consumo umano richiedono una valutazione prima di essere approvati per l'uso del consumatore da parte della Food and Drug Administration. L'onere finanziario per l'esecuzione di questo test è posto sulla sviluppatore 1, che aumenta sostanzialmente il costo di sviluppo nuovo composto e quindi si traduce in un aumento dei costi per i consumatori. Mentre tradizionalmente molto di questo screening è utilizzato soggetti animali di agire come proxy per ospiti umani, questo ha dimostrato di essere un grande onere finanziario, con una cifra stimata di 2,8 miliardi dollari spesi ogni anno in ADME / Tox (assorbimento, distribuzione, metabolismo, escrezione e tossicità ) lo screening solo 2 e la crescente evidenza che suggerisce che i modelli animali non possono prevedere in modo affidabile le risposte tossicologici umani 3. Pertanto, in fase di test delle cellule umane in vitro cultura basata ha guadagnato popolarità nel corso degli ultimi due decenni a causa della sua relativamente bassadei costi, maggiore produttività e una migliore rappresentazione della biodisponibilità umana e tossicologia 4. Attuali metodi di screening coltura cellulare basati tossicità impiegano vari endpoint, come la misurazione dei livelli di ATP, screening l'attività di enzimi citoplasmatici disponibili endogenamente, sondando l'integrità della membrana cellulare, o di monitoraggio del livello di attività mitocondriale, per valutare la vitalità cellulare 5 , 6. Tuttavia, indipendentemente l'endpoint prescelta, tutti questi metodi richiedono la distruzione del campione prima misurazioni possono essere prese, quindi solo produrre dati in un singolo punto di tempo. Di conseguenza, un gran numero di campioni devono essere preparati e trattati in parallelo per studi di base cinetica tossicologici, di nuovo aggiungendo al costo e la manodopera necessaria per nuovo sviluppo composto. In alternativa, saggi di luciferasi utilizzando secreti come Gaussia luciferasi 7, Vargula luciferasi 8, 9 e Metridia luciferasiè stato sviluppato che eliminano la necessità di lisi cellulare e richiedono una frazione dei mezzi per la misura finale, tuttavia, questi vengono ancora limitata a campionamento in punti di tempo predeterminati e inoltre richiede l'aggiunta di substrati luce-attivanti esogeni.
Per evitare danno di distruzione campione requisito nonché per eliminare il costo di substrati, una linea cellulare umana è stato ingegnerizzato che esprime la piena bioluminescenza batterica (lux) cassetta genica (luxCDABEfrp) per permettere il monitoraggio continuo di cellule vive che è simile a fluorescenza-dye imaging cellulare dal vivo a base, ma senza le ulteriori procedure di indagine fotone-attivanti e microscopiche. Questa linea cellulare è in grado di produrre costitutivamente un segnale ottico per la continua, rilevamento diretto senza bisogno di stimolazione esterna, evitando così la distruzione del campione. Meccanicamente, il segnale bioluminescente generato da queste cellule risultas quando l'enzima luciferasi luxAB-formata catalizza l'ossidazione di un grasso a catena lunga aldeide (sintetizzato e rigenerata dai prodotti genici luxCDE utilizzano substrati endogeni) in presenza di una ridotta riboflavina fosfato (FMNH 2, che viene riciclata dalla FMN dal gene frp prodotto) e ossigeno molecolare 10. Espressione del lux cassetta nella cellula ospite consente quindi leggera da produrre e accertata, senza distruzione cellulare o esogena aggiunta del substrato. Allo stesso modo, l'interazione tra i geni lux e la FMN disponibile endogena, e O 2 cofermenti, e l'obbligo per il mantenimento di un ambiente in grado di supportare la conversione di FMN a FMNH 2, assicura che il segnale bioluminescente risultante può essere rilevata solo da vivere , cellule metabolicamente attive.
Questi requisiti sono stati precedentemente sfruttato per dimostrare che lux-based uscita bioluminescente è strettamente correlato con le dimensioni della popolazione cellulare 11 e che l'esposizione composto tossico compromette produzione autobioluminescent in modo dose-risposta 12. Qui usiamo un autobioluminescent rene embrionale umano precedentemente caratterizzato (HEK293) linea cellulare 11 per dimostrare lo screening tossicologico automatizzata di un antibiotico della famiglia bleomicina con nota DNA attività dannosa come un esempio rappresentativo per convalidare l'applicazione di cellule di mammiferi autobioluminescent per test di tossicità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo metodo viene illustrato l'utilizzo di cellule di mammifero in autonomia bioluminescenti come dosaggio di screening citotossicità in vitro che permette alle cellule Live per essere monitorati continuamente durante la loro vita. Questo protocollo è flessibile e può essere modificato per accomodare condizioni sperimentali specifiche come richiesto. Per esempio, l'esperimento qui presentato è adatto per l'inseguimento effetti tossici acuti, ma può essere adattato per valutare gli ef…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questi sforzi di ricerca sono stati sostenuti dalla National Science Foundation Divisione di Chimica, Bioingegneria, ambientale e di trasporto (CBET) Sistemi di cui ai numeri premio CBET-0.853.780 e CBET-1.159.344 e il National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) con il numero award 1R43ES022567-01, e il National Cancer Institute, Cancer Imaging Program con il numero award CA127745-01. Lo strumento Lumina IVIS utilizzato in questo lavoro è stato ottenuto dalla US Army Defense University Strumentazione Research Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comment |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
Referências
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