Exosome मात्रा और आकार माप के लिए एक अभिनव पद्धति

Summary

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Abstract

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.

Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.

Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

Introduction

परिसंचारी exosomes की सटीक समारोह के समय की एक लंबी अवधि के लिए अनजान बने रहे। यहां तक ​​कि अब exosomes का पूरा पथ तंत्र पूरी तरह से समझ नहीं है। Exosomes ले जाने के बाद से एंटीजन, प्रोटीन और मूल के उनके पैतृक सेल, सेल सेल संकेत ट्रांसमीटरों के रूप में उनके कार्य के लिए उन्हें संबंधित है कि शाही सेना (mRNA और miRNA) मुख्य रूप से प्राथमिकता दी गई है।

कई अलग अलग तरीकों अलगाव और exosomes ^1,2 के मात्रात्मक पता लगाने के लिए साहित्य में वर्णित किया गया है। हालांकि, एक 'सोने के मानक' पर कोई आम सहमति पर पहुंच गया है। इस बीच exosome अनुसंधान के क्षेत्र में सक्रिय वैज्ञानिकों के बहुमत अलगाव का एक सुसंगत विधि अत्यधिक विभिन्न रिपोर्टों और अध्ययनों के बीच तुलनीयता के एक उच्च डिग्री हासिल करने के लिए warranted है कि सहमत हैं।

प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) exosome विश्लेषण ³ के लिए सबसे आम है और प्रचलित साधन है। FACS के बेन हैप्रतिदीप्ति लेबलिंग के माध्यम से, अलग अलग मूल से कोशिकाओं को एक कदम में तुलना की जा सकती है कि, efit। FACS के बड़े नुकसान भी कम उनके आकार को मापने के लिए, exosomes व्यास ⁵ में 30-120 एनएम के बीच आम तौर पर कर रहे हैं, जबकि इस विधि, कणों छोटे से अधिक 0.5 माइक्रोन ^चार की पहचान करने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं है कि कर रहे हैं।

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) कण आकार और exosomes की आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लिए अन्य उपकरण हैं। हालांकि, SEM और मंदिर दोनों नमूनों की तैयारी के समय लेने वाली है, दोनों तरीकों श्रम प्रधान कदम शामिल है कि नुकसान है और प्रत्येक विरूपण साक्ष्य पीढ़ी के कुछ जोखिम है। न तो विधि उच्च नमूना throughput और एक नमूना के एकल कणों के कई हजारों के लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, नमूने अक्सर है जहां नैदानिक ​​दैनिक दिनचर्या के लिए एक मात्रात्मक विश्लेषण एक बहुत ही कम अवधि में एक साथ या कम से कम है विश्लेषण करने के लिएप्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है। नई पीढ़ी की तकनीक अब हमें पूर्व गहन प्रारंभिक कार्य (जैसे, पर्यावरण SEM) के बिना exosomes का विश्लेषण करने की अनुमति देते हैं। ये आधुनिक तकनीक अभी भी उनकी औसत संख्या और आकार के वितरण ⁶ निर्धारित करने के लिए exosomes युक्त बड़ी मात्रा में निलंबन का विश्लेषण करने के लिए नहीं बल्कि असुविधाजनक हैं।

दृश्य और exosomes के विश्लेषण के लिए एक और बेहद संवेदनशील विधि nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) है। इस विधि भौतिकी के दो अलग-अलग सिद्धांतों का लाभ लेता है। सबसे पहले, कणों वे एक लेजर बीम के साथ विकिरणित हैं जब बिखरे हुए प्रकाश से पता चला रहे हैं। दूसरी घटना के अनुसार जो एक तरल निलंबन में अलग कणों के प्रसार उनके आकार के विपरीत आनुपातिक है, ब्राउनियन गति के रूप में जाना जाता है। उत्तरार्द्ध मामले में आंदोलन भी तापमान और तरल की चिपचिपाहट पर निर्भर करता है। फिर भी, इस दर सीधे कण आकार से संबंधित है और NTA के द्वारा किया जाता है। मुलायम का प्रयोगवेयर-आधारित विश्लेषण, एकल कणों से बिखरे हुए प्रकाश के डिजिटल छवियों दर्ज हैं। बिखरे हुए प्रकाश स्पॉट के भूखंडों और गति की अपनी गति कुल कण गिनती और आकार के वितरण का निर्धारण करने की सुविधा है कि डेटा प्रदान करते हैं। इस तकनीक को कम से कम 100 एनएम का एक मतलब व्यास के साथ कणों का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से शक्तिशाली है।

आकार और एकाग्रता माप ZetaView ब्राउनियन और वैद्युतकणसंचलन मोशन वीडियो विश्लेषण खुर्दबीन के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं। यह (इसके बाद कण ट्रैकिंग उपकरण के रूप में करने के लिए कहा गया है) तरल के नमूने के लिए एक अर्ध-स्वचालित डेस्क टॉप nanoparticle विश्लेषण साधन है। यह कण ट्रैकिंग विश्लेषक के रूप में अच्छी तरह से डेटा के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के साथ एक लैपटॉप के होते हैं। विषम जैविक नमूने अकार्बनिक कणों की अधिक सजातीय निलंबन के रूप में इस विधि के लिए के रूप में उपयुक्त हैं। एक वीडियो कैमरे के साथ एक लेजर बिखरने खुर्दबीन के कणों का पता लगाने के लिए और obse के लिए प्रयोग किया जाता हैउनके आंदोलन की rvation। माइक्रोस्कोप अक्ष क्षैतिज और exosomes युक्त निलंबन से भर सेल चैनल में ध्यान केंद्रित किया है, लेजर बीम खड़ी उन्मुख है। माइक्रोस्कोप (चित्रा 1) के माध्यम से एक डिजिटल वीडियो कैमरा से 90 डिग्री नीचे दर्ज की गई है, जो लेजर बिखराव प्रकाश ने किरणित कणों। बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता बड़े कणों 60 एनएम व्यास के अवलोकन की अनुमति देता है। इस तरह के एक सेटिंग में एक कण की चमक कण आकार के ही संकेत नहीं है। कोई बिजली के क्षेत्र लागू किया जाता है, कण आंदोलन केवल ब्राउनियन गति का अनुसरण और कण आकार की गणना के लिए एक संकेतक के रूप में सेवा कर सकता है। हालांकि, साधन भी सेल चैनल पार एक बिजली के क्षेत्र लागू करने के लिए सक्षम है। इस क्षेत्र के अधीन है, जब क्षमता, polarity और निलंबित exosomes की आयनिक प्रभारी के स्तर पर उनके आंदोलन की दिशा के आगे निर्धारकों हो जाते हैं। एक electrophoretic मो में वेग और दिशा परिणामसाख हिस्टोग्राम।

पृथक exosomes का विश्लेषण करने के लिए एक इष्टतम तरीका खोजने एक समस्या है, वहीं एक दूसरे से इस तरह खून, जलोदर, मूत्र, दूध, एमनियोटिक द्रव या सेल मीडिया के रूप में विभिन्न मीडिया से exosomes के प्रभावी अलगाव में निहित है। अलग अलग तरीकों ultracentrifugation ^एक के आधार पर कर रहे हैं, जो इस प्रकार अब तक वर्णित किया गया है, (जैसे Exoquick के रूप में) औद्योगिक जुदाई अभिकर्मकों ^7, जुदाई ⁸ या ultrafiltration रोजगार प्रतिजन के लिए चुंबकीय मोती ⁹ कदम।

इस प्रोटोकॉल में हम ultracentrifugation के माध्यम से exosome अलगाव की पूरी प्रक्रिया का प्रदर्शन और कण ट्रैकिंग साधन के माध्यम से निलंबन युक्त जिसके परिणामस्वरूप exosome विश्लेषण करने के लिए कैसे दिखा। मानव प्लाज्मा या सेल संस्कृति के माध्यम से निकाली गई exosomes के विश्लेषण के लिए विशिष्ट कारणों से प्रदान की जाती हैं।

Protocol

नोट: इस काम में प्रस्तुत प्रयोगों डसेलडोर्फ विश्वविद्यालय की संस्थागत नैतिक बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया है। 1. Exosome तैयारी (9 मिलीलीटर की कुल) venipuncture के माध्यम से तीन साइट्रेट ट्यूबों में पूरे खून ले लीजिए। एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में रक्त डालो। प्लाज्मा से कोशिकाओं के विभाजन के आरंभ करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 1500 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र। एक नया 15 एमएल फाल्कन ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। प्लाज्मा से (; सीएफपी सेल मुक्त प्लाज्मा) सभी कोशिकाओं को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 2800 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र। Ultracentrifugation ट्यूब, ट्यूब प्रति 1 मिलीलीटर सीएफपी स्थानांतरण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए एक लाख XG पर अपकेंद्रित्र exosomes व्यय करना। सतह पर तैरनेवाला के 900 μl निकालें। Ultracentrifugation ट्यूब में शेष 100 μl में गोली फिर से निलंबित। 900 μl पीबीएस जोड़ें। अपकेंद्रित्र फिर से 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक लाख XG पर। सु की 900 μl निकालेंpernatant। शेष 100 μl के साथ गोली फिर से निलंबित। स्थानांतरण पानी आसुत 40 एमएल में फिर से निलंबन के 5 से 20 μl। बड़े कणों से exosomes अलग करने के लिए एक 450 एनएम फिल्टर के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर। कण माप के लिए इस अंतिम निलंबन का प्रयोग करें। कण ट्रैकिंग उपकरण 2. स्टार्टअप प्रक्रिया सॉफ्टवेयर आइकन पर डबल क्लिक करके कार्यक्रम की शुरुआत करें। विभिन्न सॉफ्टवेयर टैब पर क्लिक करें ("सेल जाँच", "मापन", "विश्लेषण") प्रोटोकॉल भर में उन दोनों के बीच स्विच करने के लिए। स्टार्टअप प्रक्रिया के एक स्वचालित कार्यान्वयन के लिए स्क्रीन पर दिए गए निर्देशों का पालन करें। सेल गुणवत्ता की जांच और ऑटो संरेखण दोनों के लिए बॉक्स का चयन करें। नोट: इन कदमों से या तो "सेल की जांच" टैब पर बटन (एक) या (बी) दबाकर अलग से यदि आवश्यक हो तो दोहराया जा सकता है। NTA के साधन के इनलेट और आउटलेट बंदरगाह खोलने और 10 मीटर इंजेक्षनएल इनलेट पोर्ट के माध्यम से सेल चैनल में सिरिंज से पानी आसुत। पानी के अंतिम राशि इंजेक्ट किया जा रहा है के रूप में आउटलेट बंदरगाह को बंद करें। बेकार समाधान इकट्ठा करने के लिए आउटलेट बंदरगाह के तहत एक बीकर रखें। माप सेल हवा के बुलबुले के लिए स्वतंत्र है कि यह सुनिश्चित करने के लिए और इस प्रणाली में हवा के बुलबुले सिरिंज नहीं है। तुरंत इनलेट पोर्ट बंद करें। "ठीक है" पर क्लिक करके सेल गुणवत्ता की जांच करने के। सॉफ्टवेयर कुछ सेकंड के बाद सेल गुणवत्ता परिणाम प्रदर्शित करेगा। किसी भी कणों अभी भी सॉफ्टवेयर का जीना-दृश्य स्क्रीन में कल्पना कर रहे हैं या गुणवत्ता की जांच का नतीजा ही अच्छा है या खराब है, तो शेष कणों दोहराएँ जब तक 2.3 कदम माप सेल से हटा रहे हैं। इसके अलावा कणों के संचय से बचने के लिए प्रत्येक माप के बाद 2.3 कदम दोहराएँ। आसुत जल इंजेक्शन दोहरा और सेल की जांच के लिए एक "अच्छा" परिणाम का उत्पादन नहीं करता है, तो 2.9 के लिए आगे बढ़ें। वर्दी 200 एनएम आकार पीओएल युक्त नियंत्रण निलंबन तैयार करेंystyrene कणों लेजर और माइक्रोस्कोप के foci के लिए पंक्ति में इस्तेमाल किया जाएगा। 600 ± 100 कणों रहते ध्यान में रखते हुए स्क्रीन प्रति प्रदर्शित कर रहे हैं कि इस तरह के आवश्यक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आसुत पानी की 500 मिलीलीटर, उपकरण निर्माता द्वारा प्रदान की गई निलंबन ध्यान केंद्रित करने की एक बूंद जोड़ें। 2.3 कदम के रूप में वर्णित NTA के साधन में संरेखण निलंबन इंजेक्षन। प्रेस "ठीक है" ऑटो संरेखण, प्रणाली स्वतः दो foci के इष्टतम स्थिति मिलेगा, जिसके माध्यम से एक स्वचालित दिनचर्या शुरू करने के लिए। एक त्वरित प्रणाली बताते हुए प्रकट होता है माप शुरू करने के लिए ठीक पर क्लिक करें, अब प्रयोगों के लिए तैयार है। कभी-कभी, इथेनॉल के एक 30% समाधान के साथ सेल निस्तब्धता द्वारा प्रयोगों के बीच मैन्युअल रूप से सेल चैनल साफ। सॉफ्टवेयर एक स्वचालित त्रुटि रिपोर्ट को प्रदर्शित करता है जब भी चैनल साफ करें। नमूना 3. मापन ईए के लिए पहले आसुत जल के साथ चैनल फ्लश(2.3 कदम के रूप में वर्णित) CH नमूना माप। कदम 2.3 में वर्णित के रूप में, चैनल में (खंड 1 में तैयार) exosome निलंबन इंजेक्षन। जरूरत के रूप में सॉफ्टवेयर में निम्नलिखित मुख्य मापदंडों को समायोजित करें: संवेदनशीलता। इष्टतम संवेदनशीलता सीमा खोजने के लिए आदेश में, अलग-अलग संवेदनशीलता के स्तर के लिए स्क्रीन प्रति मापा कणों के लिए एक वक्र प्रदर्शित करने के लिए बटन "संवेदनशीलता बनाम कणों की संख्या" पर क्लिक करें। वक्र की अधिकतम ढलान से पहले एक संवेदनशीलता स्तर चुना है। एक उच्च संवेदनशीलता स्तर अधिक छोटे कणों के दृश्य की अनुमति देता है, लेकिन यह भी पृष्ठभूमि शोर से संबंधित मुद्दों बढ़ जाती है। न्यूनतम चमक। Exosome माप एक फिल्टर के रूप में इस समारोह का उपयोग करने के लिए 20 की एक प्रारंभिक चमक चुना है। बाहर खाली दृढ़ता से प्रकाश बिखरने कणों अप करने के लिए इस पैरामीटर का विनियमन। कलाकृतियों बिखरने कमजोर बढ़ाना करने के लिए इसे नीचे विनियमित। प्रयोग के दौरान जरूरत के रूप में चमक बदलती हैं। नोट: प्रकाश कण किबहुत दृढ़ता से ओवरलैप बिखराव और गलती से विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है। न्यूनतम और अधिकतम आकार। न्यूनतम और अधिकतम आकार के विनियमन के द्वारा बड़े कणों से पिक्सेल शोर और अवांछित बिखराव को खत्म करने के लिए एक डिजिटल फिल्टर सेट करें। Exosomes की माप के लिए 10-500 पिक्सल की एक सीमा का उपयोग करें। शटर। कैमरा 1/300 सेकंड के लिए खुला है कि समय की अवधि को समायोजित करें। बाहर पढ़ने के मापदंडों लाइव: "लाइव छवि" बटन पर क्लिक करके किसी भी बिंदु पर एक डिजिटल और एक अनुरूप देखें ढंग के बीच स्विच करें। प्रयोग के दौरान, एक रंग कोडित संकेतक के रूप में नमूने के संतृप्ति की स्थिति को दिखाता है जो बिखरने तीव्रता बार, निगरानी। बिखरने बार लाल है अगर exosomes का विश्लेषण न करें। ऐसे एक मामले में आगे की इस घटना से बचने के लिए नमूना पतला। प्रयोगात्मक हालत नमूना निलंबन के हेरफेर पर प्रतिबंध लगाता है, तो संवेदनशीलता नीचे विनियमित या सॉफ्टवेयर-एस में चमक को विनियमितettings माप परिणामों में सुधार करने के लिए। नोट: कणों की एक अत्यंत उच्च एकाग्रता के साथ नमूनों का विश्लेषण कर रहे हैं जब बिखराव व्यक्तिगत कणों फ्यूज होगा और वे एक एक कण के रूप में गिना जाता है। प्रदर्शन से दर्शन के क्षेत्र में गिना कणों की संख्या पर ध्यान दें। "मापन" टैब पर क्लिक करें। "चलाने के विकल्प" सरणी में सेटिंग चुनें। प्रत्येक अधिग्रहण से पहले, एक बार चेक कण बहाव परीक्षण के लिए "चेक आंदोलन 'का चयन करें। पूरे विश्लेषण शुरू करने से पहले कम से कम एक बार परीक्षण प्रदर्शन। बहाव अधिक से अधिक 20 माइक्रोन / सेकंड है, तो नमूना बह बंद हो जाता है, ताकि माप जारी रखने से पहले प्रतीक्षा करें। प्रयोगों की संख्या (5) और उन दोनों के बीच के समय में देरी (0) का चयन करें। एक "नमूना की जांच 'यदि आवश्यक हो तो प्रदर्शन करना। इस परीक्षण के लिए शुरू की प्रक्रिया में ऑटो संरेखण का हिस्सा है और जरूरत के रूप में बाद में दोहराया जा सकता है। </ली> अंत में "चलाने वीडियो अधिग्रहण" बटन पर क्लिक करें। नए विंडो में चक्रों की संख्या (15) और माप पदों की संख्या (11) को परिभाषित। नोट: लेजर सिर और माइक्रोस्कोप 11 विभिन्न पदों पर कण संख्या का विश्लेषण करने के लिए ले जाया जा सकता है। प्रयोगात्मक मांग पर निर्भर करता है, प्रयोग एक ही स्थान पर या अलग अलग स्थानों पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए कि क्या निर्णय लेते हैं। एक कण वीडियो संकल्प (कम) की स्थापना करके एक व्यक्ति कण के रूप में गिना जाएगा लगाया जा करने के लिए है कम से कम समय अवधि की पुष्टि करें। एक छोटी ट्रैकिंग अवधि में एक कम संकल्प का परिणाम है। एक फ़ाइल-नाम का चयन करें और माप शुरू करने के लिए "ठीक" पर क्लिक करें। परिणाम 4. व्याख्या "परिणाम" टैब पर माप के बाद प्रदर्शित निम्न परिणाम और मानकों देखें: पता लगाया कणों (1) कुल संख्या, भाग (2) के औसत संख्यास्थिति, और (3) कण एकाग्रता प्रति icles। कण संख्या का प्रतिशत करने के कण आकार (व्यास, सतह और मात्रा) के संख्यात्मक अनुपात के लिए परिणाम औसत तालिका दृश्य, साथ ही मतलब है और मानक भेदभाव के मूल्यों। एक से अधिक शिखर चित्रमय विश्लेषण में मौजूद है अगर शिखर विश्लेषण तालिका का उपयोग करें। इस तालिका में पहले या क्रमश: दूसरे शिखर की तुलना में छोटे होते हैं कि कणों के वितरण से पता चलता है। आकार से कणों की एक वितरण को देखने के लिए माप के बाद की गणना ग्राफ देखें। सेटिंग्स बदलने के लिए प्रदर्शन मोड में और ग्राफ ऊपर माउस का प्रयोग करें।

Representative Results

इस प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया नमूना 85% की संवेदनशीलता, संवेदनशीलता वक्र की अधिकतम ढलान से पहले (चित्रा 2) के साथ माप के लिए एक इष्टतम सेटिंग से पता चलता है। प्रोटोकॉल में सिफारिश के रूप में चमक, न्यूनतम / अधिकतम मूल्यों चुने गए हैं। 5.3 कणों की एक एकाग्रता / एमएल एक्स कणों का मतलब आकार उनमें से ज्यादातर 0.137 माइक्रोन थे, .149 माइक्रोन था, जबकि 10 6, मापा गया था। माप के बाद प्राप्त मूल्यों .pdf की एक फ़ाइल स्वरूप के साथ या एक डेटाबेस में निर्यात के लिए एक .txt के रूप में एक रिपोर्ट में बचाया जा सकता है। पसंदीदा के रूप में प्रोटोकॉल (धारा 4) में वर्णित के रूप में ग्राफ समायोजित किया जा सकता है। वीडियो अनुक्रम भी सहेजा जाता है और बाद में बंद लाइन फिर से विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इस तरह के एक बंद लाइन विश्लेषण में, कैमरे के पूर्व अधिग्रहण सेटिंग्स पूर्वव्यापी बदला नहीं जा सकता। एक माप के लिए इष्टतम पैरामीटर सेटिंग्स को खोजने के क्रम में, हम यहाँ वें वर्णनएक 100 एनएम polystyrene के आकार के मानक के उदाहरण पर साधन सेटिंग्स के ई अनुकूलन। दो मापदंडों, वीडियो छवि और कण आकार के वितरण पर संवेदनशीलता और न्यूनतम / अधिकतम आकार के प्रभाव के बारे में विस्तार से चर्चा की है। अन्य सभी मापदंडों तालिका 1 में संक्षेप हैं। एनालॉग और डिजिटल छवियों पर (50-94 लेकर) संवेदनशीलता के प्रभाव का एक दृश्य प्रभाव चित्रा 3 में कल्पना की है। छवियों से व्युत्पन्न मात्रात्मक जानकारी तालिका 1 में सेटिंग के आधार पर, चित्रा 4 में प्रस्तुत किया है, न्यूनतम आकार = 5 और अधिकतम आकार = 200 संवेदनशीलता बनाम पता लगाया कणों की संख्या का एक विशिष्ट संबंध चित्रा -4 ए में दिखाया गया है। 50 और 90 के बीच, पता चला कणों की संख्या संवेदनशीलता के साथ वृद्धि हुई है और 90> संवेदनशीलता के लिए नाटकीय रूप से बढ़ गई। संवेदनशीलता के एक इष्टतम रेंज में 66 और 86 (ए) के बीच पाया गया था। कण आकार वितरण अलग से प्राप्तअलग संवेदनशीलता सेटिंग्स 4B चित्रा में दिखाए जाते हैं। कण आकार वितरण तीन अलग-अलग माप का मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं। बल्कि गरीब आँकड़ों में जिसके परिणामस्वरूप केवल कुछ कणों का विश्लेषण किया गया है बहुत कम एक संवेदनशीलता (संवेदनशीलता = 62, लाल वक्र) के लिए। विश्लेषण किया कणों की संख्या संवेदनशीलता के साथ वृद्धि हुई है और 70 (पीले वक्र) और 86 (तन वक्र) के बीच एक इष्टतम पर पहुंच गया। इसके अलावा छोटे आकार (संवेदनशीलता = 94, नीला वक्र) की ओर जा रहा छोड़ने के कणों और आकार के वितरण की संख्या के साथ कण आकार के वितरण की गिरावट के लिए संवेदनशीलता का नेतृत्व बढ़ रही है। चित्रा 4C की संख्या के आधार X50 व्यास की प्रवृत्ति (50% से पता चलता है कणों संवेदनशीलता के एक समारोह के रूप में) इस व्यास से छोटे हैं। लाल क्षेत्रों गरीब सांख्यिकी (संवेदनशीलता बहुत कम है) या व्यापक वितरित करने का एक परिणाम के रूप में> 8% RSD संकेत मिलता बेज अंतराल में, कण आकार के आर एस डी कम से कम 8% थी और ए में इष्टतम अंतराल से मेल खाती हैछोटे आकार (संवेदनशीलता बहुत अधिक) के लिए बदलाव के साथ butions। न्यूनतम आकार और अधिकतम आकार की सेटिंग में न्यूनतम आकार से छोटा और अधिकतम आकार से बड़ा स्थान आकार के साथ कणों को दूर करने के क्रम में डिजिटल छवियों के लिए लागू फिल्टर कर रहे हैं। प्रकाश तितर बितर करने की क्षमता के कारण, एक कण एक डिजिटल छवि पर एक निश्चित आकार की एक जगह बनाता है। स्थान के आकार पिक्सल के एक नंबर (PX) के रूप में मापा जाता है। एक कण बहुत अच्छी तरह से (जैसे, कणों> 200 एनएम या समुच्चय) प्रकाश scatters करते समय, स्थान आकार जैसे,> 500 पिक्सल, काफी बड़ी है। स्थान आकार कण सामग्री के आधार पर छोटे कणों (जैसे, <20 एनएम) के लिए (जैसे, <10 पिक्सल) काफी छोटा है। वे समान नहीं हैं और इन दो चर के बीच कोई सीधा संबंध नहीं है के रूप में स्थान आकार (पिक्सेल) कण आकार (एनएम) के साथ interchanged नहीं किया जा सकता है। न्यूनतम और अधिकतम आकार के एक अनुकूलन उपयोगकर्ता ऐसे agglomerates (अधिकतम आकार) या छोटे के रूप में अवांछित वस्तुओं बाहर फिल्टर करने के लिए अनुमति देता हैऐसी पृष्ठभूमि शोर (मिन आकार) के रूप में वस्तुओं। एक 100 एनएम आकार के मानक के कण आकार के वितरण पर न्यूनतम / अधिकतम आकार के प्रभाव चित्रा 4D (संवेदनशीलता = 82) में दिखाया गया है। अंतराल छोटी सी जगह आकार के लिए सेट किया जाता है (उदाहरण के लिए, न्यूनतम = 1, अधिकतम = 52; नारंगी वक्र), विश्लेषण किया कणों की संख्या कम हो जाता है और संख्या के आधार X50 व्यास थोड़ा छोटे आकार की दिशा में स्थानांतरित कर दिया है। बड़े स्थानों के लिए सेटिंग (न्यूनतम = 40, अधिकतम = 1,000; लाल वक्र) एक व्यापक कण आकार के वितरण में परिणाम बड़े आकार की दिशा में स्थानांतरित कर दिया। कणों के बराबर कुल संख्या प्राप्त करने के लिए, नारंगी और लाल दोनों वितरण के अंतराल सीमाओं 80 कणों मैच के लिए समायोजित किया गया। इष्टतम सेटिंग्स के साथ वितरण (न्यूनतम = 5, अधिकतम = 200; तन वक्र) 360 कणों के होते हैं। सफल प्रयोगों की एक श्रृंखला exosomes ultracentrifugation द्वारा पृथक और प्रस्तुत प्रणाली का उपयोग कर NTA के द्वारा मापा के साथ प्रदर्शन किया गया। परिणामी डेटा अत्यधिक थेसुसंगत और reproducibility के एक उच्च स्तर की पुष्टि की। अन्य अलगाव विधियों इसी तरह के परिणाम दिखाना चाहिए। हालांकि, कमजोर पड़ने कदम के लिए एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण कदम के रूप में पहचान की थी और कणों की गणना की कुल संख्या पर इसके प्रभाव को फिर से मूल्यांकन किया जाना है। NTA की स्थापना की चित्रा 1. योजनाबद्ध। माइक्रोस्कोप / वीडियो अक्ष और लेजर बीम सेल चैनल पार अनुभाग में पार कर, एक दूसरे से orthogonally केंद्रित कर रहे हैं। कणों से बिखरे हुए प्रकाश सॉफ्टवेयर का "जी-व्यू" विंडो में प्रदर्शित किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <stronसंवेदनशीलता वक्र बनाम कणों की जी> चित्रा 2. संख्या। संवेदनशीलता वक्र बनाम कणों की संख्या एक स्वत: संवेदनशीलता स्कैन के दौरान एक पल में एक स्थिति में कणों को प्रदर्शित करता है। इस चित्रमय दृश्य प्रारंभिक मापन के लिए सबसे अच्छा वरीयताओं को निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक संवेदनशीलता मूल्य ग्राफ की अधिकतम ढलान करने से पहले चुना जाता है। यह कलाकृतियों इस परीक्षण के प्रयोग में समाप्त नहीं कर रहे हैं और ग्राफ को प्रभावित कर सकते हैं कि याद रखना महत्वपूर्ण है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। लाइव देखें स्क्रीन पर कणों के एनालॉग और डिजिटल छवि। दृश्य पर संवेदनशीलता की चित्रा 3. प्रभाव दोनों अनुरूप (शीर्ष पंक्ति) एक के लिए 50 और 94 के बीच संवेदनशीलता के लिए प्रदर्शित किया जाता हैडी डिजिटल (नीचे पंक्ति) विचार। संवेदनशीलता बहुत कम हो गया है, केवल कुछ कणों (बाएं) का पता लगाया जाता है। इष्टतम संवेदनशीलता पर कणों अच्छी तरह से एक दूसरे को (मध्य) से अलग रूप में एकल डॉट्स दिखाई देते हैं। एक अपेक्षाकृत उच्च संवेदनशीलता के कणों को एक साथ गरीब छवि गुणवत्ता (दाएं) के लिए अग्रणी विलय की। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। एक नियंत्रण 100 एनएम polystyrene के कण नमूने के लिए संवेदनशीलता न्यूनतम और अधिकतम आकार सेटिंग की चित्रा 4. प्रभाव (ए) के कणों का पता लगाया संख्या बनाम संवेदनशीलता का प्लॉट। इष्टतम अंतराल, 66-86 वक्र की अधिकतम ढलान से पहले है। (बी) के कण आकार वितरण कई संवेदनशीलता सेटिंग्स (62-94 के साथ प्राप्त); (62) बहुत कम या बहुत अधिक के लिए रेखांकन (94) संवेदनशीलता 100 एनएम polystyrene के नियंत्रण नमूना के लिए कण आकार के वितरण पर कब्जा नहीं है। (सी) संवेदनशीलता बनाम संख्या के आधार X50 व्यास; बेज अंतराल में X50 की त्रुटि कम से कम 8%, इष्टतम अंतराल 66 से कण आकार के वितरण पर न्यूनतम और अधिकतम आकार के 86 (डी) प्रभावित करने के लिए है; इष्टतम मानकों (न्यूनतम = 5 और अधिकतम = 200) पर नियंत्रण के नमूने के लिए सही वितरण पर कब्जा। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। प्री-अधिग्रहण मापदंडों संवेदनशीलता परिवर्तनशील शटर 40 फ्रेम दर 30 एफपीएस संकल्प हायजीएच साइकिल 10 एकाधिक अधिग्रहण 3 स्थान 1 पोस्ट-अधिग्रहण मापदंडों मिन चमक 30 अधिकतम आकार परिवर्तनशील न्यूनतम आकार परिवर्तनशील कण ट्रैकिंग उपकरण की स्थापना के लिए पूर्व और बाद के अधिग्रहण मापदंडों की तालिका 1. सारांश।

Discussion

हम एक जैविक तरल पदार्थ में exosome आकार और एकाग्रता को मापने के लिए एक उपन्यास और अभिनव तरीके के रूप में रक्त और वर्तमान nanoparticle ट्रैकिंग से exosome अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है। प्रस्तुत प्रयोगों में मानव परिधीय रक्त exosomes की उत्पत्ति के रूप में इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, इस तरह के आदि मूत्र, थूक, सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला, के रूप में अन्य मूल, यह भी परीक्षण सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

मानव में exosome एकाग्रता के जैविक परिवर्तनशीलता के आधार पर अलग-अलग व्यक्तियों से assays के exosomes की एक उल्लेखनीय बदलती एकाग्रता सुविधा हो सकती है। हालांकि, जैविक परीक्षण जांच में कणों की एकाग्रता परिणामों पर एक प्रभाव हो सकता है। इसलिए, जांच के कमजोर पड़ने के लिए एक विश्वसनीय और मानकीकृत दृष्टिकोण की जरूरत है। प्रस्तुत विधि में exosome युक्त प्लाज्मा परिधीय पूरे रक्त के 9 मिलीलीटर से उत्पन्न किया गया। अंतर centrifugation का उपयोग एक exosome गोली से पृथक किया गया कदमों1 मिलीलीटर प्लाज्मा और निलंबित exosomes की कार्यप्रणाली का नमूना में परिणाम के लिए आसुत जल 5 मिलीलीटर में निलंबित कर रहे हैं। यह पूर्व निर्धारित सेटिंग कणों का एक उचित एकाग्रता, NTA के दौरान यानी, उचित बिखराव तीव्रता के साथ हमें प्रदान किया है। मात्रा और कमजोर पड़ने पहलू के अलावा, इस्तेमाल कर रहे हैं कि समाधान की रचना महत्व का भी है। हम exosomes के अंतिम फिर से निलंबन के लिए आसुत जल का इस्तेमाल किया है। बेशक, अंतिम कमजोर पड़ने कदम के लिए विभिन्न मीडिया भी प्रयोगात्मक सेट अप की आवश्यकताओं के अनुसार, इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, एक बफरिंग क्षमता के साथ नमूनों का परीक्षण विशेष रूप से जब आयनिक-समाधान के जीटा संभावित माप, के मामले में, अशांति मुक्त परिस्थितियों में एक विवेकपूर्ण कमजोर पड़ने से उपयोगी है। कई नमूने के प्रत्यक्ष तुलना के लिए हम सभी नमूनों के लिए एक ही कमजोर पड़ने स्तर रखने की सलाह देते हैं। संवेदनशीलता और वीडियो संकल्प को छोड़कर सभी सेटिंग्स ZetaView विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बाद में बदला जा सकता है।

<p class="लेखकों" के साथ शुरू की प्रणाली वर्तमान में सबसे उपयुक्त साधन का प्रतिनिधित्व करता है मानना ​​है कि "हालांकि jove_content">, यह केवल उपलब्ध NTA व्यवस्था नहीं है। पिछली रिपोर्टों के एक नंबर से एक ही NTA के सिद्धांतों को लागू लेकिन कुछ भिन्न सुविधाओं ¹⁰ के साथ चला जाता है कि एक और उपकरण डिजाइन प्रदान करना है कि अन्य प्रणालियों कार्यरत है। हम परिणाम का नमूना हैंडलिंग और reproducibility के विषय में व्यावहारिक पहलुओं exosome मूल्यांकन के लिए पद्धति अनुक्रम को चुनने के लिए केंद्रीय महत्व के हैं कि विश्वास करते हैं। हम यह भी एक आदर्श पहचान प्रणाली के मापन के परिणामों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि उपयोगकर्ता के आधार कारकों को समाप्त करना चाहिए कि विश्वास करते हैं। यहां प्रस्तुत किया है कि exosome विश्लेषण दृष्टिकोण एक उच्च डिग्री करने के लिए आसान से निपटने की कसौटी को पूरा। एक और लाभ के रूप में, नमूनों की अर्ध-स्वचालित विश्लेषण एक कम समय में परिणाम पैदा करने, एक तेजी से प्रक्रिया में किया जाता है। Exosomes की एक ऑनलाइन दृश्य गा करने विश्लेषक एड्सexosome विशेषताओं, जैसे, सकल एकाग्रता के एक पल विचार में।

यहाँ प्रस्तुत माप तकनीक के लिए एक बहुत ही सरल लेकिन सुरुचिपूर्ण अलावा एंटीबॉडी में लेबल exosomes के उपयोग और डिटेक्टर के सामने एक पूर्ववर्ती फिल्टर का उपयोग करके बिखरे हुए लेजर बीम का कब्जा है। इस रास्ते में exosome उप-जनसंख्या एक चयनात्मक फ्लोरोसेंट धुंधला करने के लिए तकनीकी रूप से सुलभ हैं कि उनकी सतह एंटीजन और अन्य जैविक रूप से प्रासंगिक विशेषताओं के अनुसार प्रतिष्ठित किया जा सकता है।

हमारे कण ट्रैकिंग साधन के वर्तमान संस्करण का एक नुकसान यह बहुत ही उच्च संवेदनशीलता के स्तर पर इस तरह की पृष्ठभूमि शोर के रूप में कलाकृतियों सेल चैनल दीवार पर आधारित है, जो वर्तमान हो सकता है कि इस तथ्य है। मौजूदा व्यवस्था करने के लिए एक तकनीकी समाधान और सुधार के लिए निकट भविष्य में उपलब्ध हो सकता है। चैनल दीवार पर लेजर बिखराव प्रकाश की इस पद्धति का प्रतिबिंब द्वारा जिससे बढ़ रही है, कम हो जाएगा मापा संकेतों और प्राप्त डेटा और पता लगाने की सीमा को कम करने की सटीकता की।

Exosome अलगाव के लिए वर्तमान में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित और लागू कण ट्रैकिंग साधन 30 एनएम के एक कम आकार के वितरण के साथ एक उल्लेखनीय सटीक संकल्प किया जाता है, पता लगाया कणों वास्तव में पूरी तरह सच exosomes हैं कि वहाँ कोई गारंटी नहीं है। ऐसे मृत सेल टुकड़े या बड़ा प्रोटीन परिसरों के रूप में अन्य कणों भी exosome निलंबन में मौजूद हो सकता है और झूठी सकारात्मक संकेतों को जन्म दे सकती है। इस तरह के "प्रदूषण" इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम), पारेषण ईएम या स्कैनिंग ईएम या तो हो सकता है बाहर रखा जा सकता है जिसके द्वारा एक विश्वसनीय तरीका। पहले से प्रस्तावित सतह मार्करों के एक नंबर tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9, आदि के ¹¹ सहित ध्यान की एक बढ़ती हुई राशि, अर्जित किया है, हालांकि दुर्भाग्य से, exosomes के लिए कोई सामान्य और विशिष्ट मार्कर, अब तक पहचान की गई है।

"> चाहे exosome जीव विज्ञान, विशेष रूप से exosome विशिष्ट मार्करों के विषय पर अनुसंधान के भविष्य की प्रगति की है, यहाँ प्रस्तुत किया है कि प्रोटोकॉल अलगाव और exosomes का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करेगा। एकाग्रता और आकार में आसानी से एक सॉफ्टवेयर की मदद से निर्धारित किया जा सकता है सीधा फैशन। चयनात्मक फ्लोरोसेंट मार्करों या फ्लोरोफोरे युग्मित एंटीबॉडी के अलावा आगे जाने की संभावना NTA के प्रस्तुत दृष्टिकोण के संभावित अनुप्रयोगों में वृद्धि होगी।

Materials

Name of the Reagent
Citrate tube	BD	364305	BD Vacutainer
Distilled water	Braun	3880087	Aqua ad iniectabilia
Falcon tube	Greiner Bio One	188271	PP Tube, Steril 15ml
Ultracentrifugation tube	Beckman	357448	Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml
Polybead	Polysciences, Inc.	07304	2,6% Solids-Latex Alignment Solution
Syringe (Filter)	Braun	4617053V	5ml
Syringe (ZetaView)	Braun	4606051V	5ml
Needle	BD	305180	BD Blunt Fill Needle
Filter	Sartorius Stedim	16555	Syringe filter, hydrophilic, 450µm
Material Name
Ultracentrifuge	Beckman	L8-M	Rotor: 70Ti Ser. No E21078
ZetaView	Particle Metrix	PMX 100, Type 101
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Rotor: A-4-44