عزل الخلوية الدهون قطرات: اثنان تقنيات تنقية بدءا من خلايا الخميرة ومشيمة الآدمي
Summary
اثنين من التقنيات لعزل قطرات الدهون الخلوية من 1) خلايا الخميرة و 2) يتم عرض مشيمة الآدمي. محور كل الإجراءات هو كثافة الطرد المركزي التدرج، حيث طبقة عائمة الناتجة تحتوي على قطرات يمكن تصور بسهولة بالعين، المستخرج، وكميا عن طريق تحليل لطخة غربية للنقاء.
Abstract
قطرات الدهون هي العضيات الحيوية التي يمكن العثور عليها في معظم الخلايا بدائية النواة حقيقية النواة وبعض. هيكليا، تتكون قطرات من مجموعة أساسية من الدهون محايدة محاطة أحادي الطبقة فوسفورية. كان واحدا من أكثر التقنيات المفيدة في تحديد أدوار الخلوية من قطرات تحديد البروتين من البروتينات ملزمة، والتي يمكن أن تكون معزولة جنبا إلى جنب مع قطرات. هنا، يتم وصف طريقتين لعزل قطرات الدهون والبروتينات الخاصة بهم المنضم من اثنين واسعة النطاق حقيقيات النوى: الخميرة الانشطار وخلايا المشيمة الزغابي الإنسان. على الرغم من كل التقنيات لديها خلافات، والأسلوب الرئيسي – يتم مشاركتها من قبل كل من الاستعدادات – التدرج الكثافة الطرد المركزي. وهذا يدل على تطبيق واسع من تقنيات العزل الحبرية المقدمة.
في البروتوكول الأول، يتم تحويل خلايا الخميرة في spheroplasts بواسطة الهضم الأنزيمي من جدران الخلايا الخاصة بهم. وspheroplasts الناتجة ثم يتم جنتلاي هي lysed في الخالط فضفاضة. يضاف إلى Ficoll المحللة لتوفير التدرج الكثافة، ويتم طرد الخليط ثلاث مرات. بعد تدور الأولى، يتم ترجمة قطرات الدهون إلى طبقة العائمة بيضاء اللون من أنابيب الطرد المركزي جنبا إلى جنب مع الشبكة الإندوبلازمية (ER)، غشاء البلازما، والفجوات. وتستخدم اثنين من يدور لاحقة لإزالة هذه العضيات الثلاثة الأخرى. والنتيجة هي الطبقة التي ليس لديها سوى قطرات والبروتينات ملزمة.
في البروتوكول الثاني، يتم عزل الخلايا المشيمة الزغابي من مشيمة الإنسان على المدى بواسطة الهضم الأنزيمي مع التربسين والدناز أولا والمتجانس الخلايا في الخالط فضفاضة. تستخدم السرعة المنخفضة والمتوسطة السرعة الطرد المركزي خطوات لإزالة الخلايا غير منقطعة، والحطام الخلوية، نوى، والميتوكوندريا. يضاف السكروز إلى جناسة لتوفير التدرج الكثافة ويتم طرد الخليط لفصل قطرات الدهون من cellula أخرىالكسور ص.
يتم تأكيد نقاء قطرات الدهون في كلا البروتوكولين من خلال تحليل لطخة غربية. الكسور قطرات من كلا محضرات هي مناسبة لاحقة تحليل البروتين وlipidomic.
Introduction
قطرات الدهون الخلوية هي العضيات الحيوية التي تخدم وظائف متعددة في الخلايا. فهي محاور لتخزين الدهون المحايدة، والتي يمكن تحويلها إلى طاقة أو تستخدم لتخليق فوسفورية. قطرات تلعب دورا محوريا في الظروف الفسيولوجية والمرضية بما في ذلك تصلب الشرايين، والسمنة والأمراض الاستقلابية ذات الصلة، وكذلك الأمراض المعدية 1،2. بالإضافة إلى ذلك، فهي مصادر فضول للوقود وقود الديزل الحيوي.
لقد تم الحصول على الكثير من المعلومات حول أدوار الخلوية من قطرات الدهون من تحليل البروتين وlipidomic من قطرات تنقيته من الكائنات الحية واسعة النطاق 3. وقد شملت هذه الكائنات البكتيريا 4،5، الخميرة 6-11، والنباتات 12،13 والديدان الخيطية 14، 15،16 والذباب. نظرا للاهتمام في دور قطرات الدهون في الأمراض الاستقلابية الإنسان، كما تم عزل قطرات من الخلايا الحيوانية مثقف ونيمال الأنسجة. وشملت خطوط خلايا مستنبتة الخلايا الشحمية 3T3-L1 17، الهامستر الصيني المبيض (شو) الخلايا K2 18، 19،20 hepatocyes الإنسان، وخطوط الخلايا الظهارية 21. وشملت الأنسجة الحيوانية التي تم عزلها قطرات الماوس الهيكل العظمي العضلات 22، 23 الكبد، والغدد الثديية 23. كما ذكر أعلاه، فإن الهدف من معظم الدراسات الحبرية العزلة هو إجراء تحليل البروتين على عوامل مقيدة وتحليل lipidomic على الحياد والدهون الفوسفاتية.
منذ الدهون محايدة – المكون الأكثر عددا من قطرات الدهون – أقل كثافة من معظم المواد الخلوية الأخرى، وقد جرت العادة على إجراء عزل قطرات باستخدام التدرج الكثافة الطرد المركزي. هذا الأسلوب هو محور كل من محضرات المقدمة هنا. التقنيات السابقة 6،24 يتم الجمع بين وتعديلها في عرض تقديمي مرئي للعزل قطرات من خلايا الخميرة الانشطار مثقفوالخلايا البشرية noncultured تم الحصول عليها من أنسجة المشيمة. والهدف هو إظهار تطبيق واسعة من هذه التقنية عن طريق اختيار اثنين من أنواع مختلفة من الخلايا واسع نظرا نقاط البدء لعزل الحبرية. وينبغي أن يكون هذا الأسلوب مفيدا لأولئك الذين يرغبون في عزل قطرات من معظم الكائنات الحية.
بروتوكول 1 يصف عزل قطرات الدهون من الخميرة الانشطار، السكيراء pombe، التي استخدمت كنموذج لمراقبة تشكيل الحبرية خلال انقسام الخلايا حقيقية النواة 25. تم استخدام الخميرة في مهدها خميرة الخباز على نطاق واسع باعتبارها النموذج الحي لدراسة الدهون الحبرية علم الأحياء. بروتوكول 1 ينطبق على كل الكائنات الحية والاختلافات في الاستعدادات وتسليط الضوء عليها.
بروتوكول 2 يصف عزل قطرات الدهون من خلايا المشيمة الزغابي، والتي هي بدورها حصلت عليها من مشيمة الإنسان الأجل. المجموعة من مشيمة الأجل يوفر فرصة فريدة بأمان وأخلاقيا للحصول على 200-250 غرام من الأنسجة البشرية المتاحة بسهولة 26، والذي يحتوي على أعداد كبيرة من قطرات الدهون. هذا هو على النقيض من معظم أعمال الدهون الحبرية العزلة في حقيقيات النوى أعلى حيث تنشأ قطرات من الخلايا المستزرعة. في تلك الدراسات، وغالبا ما يضاف الأحماض الدهنية للثقافة لتعزيز تخليق الدهون المحايدة، وبالتالي نمو قطرات. هذا هو على النقيض من العمل هنا حيث تتشكل قطرات الدهون تحت ظروف الأصلي في أنسجة المشيمة.
يتم تحديد درجات نقاء من الكسور الدهون قطيرة من خلال تحليل لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة علامة عضية. وسوف تسفر هذه البروتوكولات اثنين من الدهون الكسور الحبرية التي هي مناسبة لاحقة تحليل البروتين وlipidomic.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة في هذا البروتوكول
تأكد من أن تكون متسقة مع وسائل الاعلام وكثافة الخلايا أثناء نمو الخلايا المستزرعة. قطرات الدهون الخلوية هي فريدة من نوعها في أن البروتينات المرتبطة بها تعتمد اعتمادا كبيرا على …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل على جائزة جمعية القلب الأمريكية 13SDG14500046 لPD، والتعليم والطاقة المستدامة بحوث جائزة مركز (جامعة تينيسي) إلى PD، والتعليم الطبي والأطباء ومؤسسة أبحاث (جامعة تينيسي) الجائزة إلى JM و الكتاب أشكر كارولين Leplante (ييل جامعة.) لبروتوكول لتحويل الانشطار الخميرة لspheroplasts؛ اريك T. بودر (جامعة تينيسي) لاستخدام له حاضنات الهز، منضدية أجهزة الطرد المركزي، والبقعة الغربية المعدات التحليل؛ ومركز ل التكنولوجيا الحيوية البيئية (جامعة تينيسي) لاستخدام أجهزة الطرد المركزي الخاصة بهم، فائقة؛ غونتر داوم عن الأجسام المضادة الخميرة (غراتس جامعة للتكنولوجيا، النمسا)؛ موظفي قسم التوليد وأمراض النساء (مركز Univ. تينيسي الطبية) لتقديم المساعدة التقنية .
Materials
| PROTOCOL #1: | |||
| 1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 liter glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 liter flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| PROTOCOL #2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine science tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine science tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine science tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml beakers | |||
| 15 ml centrifuge tubes | |||
| 10 ml serological pipettes | |||
| 50 ml centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5000 |
| NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| primary antibodies for PROTOCOL #1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| primary antibodies for PROTOCOL #2 | |||
| perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| calnexin | Cell Signaling technology | 2679 | dilution 1:1000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling technology | 4850 | dilution 1:1000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
Referências
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
