Isolatie van Cellulaire lipidedruppeltjes: Twee zuiveringstechnieken Vanaf gistcellen en Human placenta
Summary
Twee technieken voor het isoleren van cellulaire lipide druppeltjes uit 1) gistcellen en 2) humane placenta worden gepresenteerd. De kern van beide procedures is dichtheidsgradiëntcentrifugatie, waar de resulterende drijvende laag met de druppeltjes gemakkelijk kan worden gevisualiseerd door oog, gewonnen, en gekwantificeerd door Western Blot analyse voor zuiverheid.
Abstract
Lipidedruppeltjes zijn dynamische organellen die gevonden kunnen worden in de meeste eukaryote en bepaalde prokaryote cellen. Structureel, de druppels uit een kern van neutrale lipiden omringd door een fosfolipide monolaag. Een van de meest nuttige technieken het bepalen van de cellulaire rol van druppels is proteomische identificatie van gebonden eiwitten, die kunnen worden geïsoleerd met de druppels. Hier worden twee methoden beschreven om lipide druppels en hun gebonden eiwitten te isoleren van twee brede eukaryoten: splijtgist en menselijke placenta villous cellen. Hoewel beide technieken verschillen, de belangrijkste methode – dichtheidsgradiëntcentrifugatie – wordt gedeeld door beide preparaten. Dit toont de brede toepasbaarheid van de gepresenteerde druppel isolatietechnieken.
In het eerste protocol, worden gistcellen omgezet in sferoplasten door enzymatische afbraak van de celwanden. De resulterende sferoplasten worden vervolgens gently gelyseerd in een loszittende homogenisator. Ficoll wordt toegevoegd aan het lysaat aan een dichtheidsgradiënt geven en het mengsel wordt driemaal gecentrifugeerd. Na de eerste rotatie, worden de lipidedruppeltjes gelokaliseerd in het witgekleurde drijflaag van de centrifugebuizen met het endoplasmatisch reticulum (ER), de plasmamembraan en vacuolen. Twee daaropvolgende spins worden gebruikt om deze drie andere organellen verwijderen. Het resultaat is een laag die alleen druppels en gebonden eiwitten heeft.
In het tweede protocol, worden placenta villous cellen geïsoleerd uit menselijke term placenta door inwerking van het enzym trypsine en DNase I. De cellen worden gehomogeniseerd in een loszittende homogenisator. Lage snelheid en gemiddelde snelheid centrifugeren stappen worden gebruikt om gebroken cellen, cellulaire puin, kernen, en mitochondriën verwijderen. Sucrose wordt aan het homogenaat tot een dichtheidsgradiënt geven en het mengsel wordt gecentrifugeerd om de lipide druppels onderscheiden van andere cellular fracties.
De zuiverheid van het lipide druppels in beide protocollen wordt bevestigd door Western Blot analyse. De druppel fracties uit beide desinfectantia zijn geschikt voor latere proteomics en lipidomic analyse.
Introduction
Cellulaire lipide druppels zijn dynamische organellen die meerdere functies dienen in cellen. Ze zijn opslag knooppunten voor neutrale lipiden, die kan worden omgezet in energie of voor fosfolipide synthese. De druppels spelen een centrale rol in fysiologische en pathologische omstandigheden waaronder atherosclerose, obesitas en gerelateerde metabole ziekten, en ook infectieziekten 1,2. Bovendien, ze zijn intrigerend bronnen voor biodiesel.
Veel informatie over de cellulaire rol van lipide druppels is verkregen van proteomics en lipidomic analyse van druppeltjes gezuiverd uit uiteenlopende organismen 3. Deze organismen hebben opgenomen bacteriën 4,5, gist 6-11, planten 12,13, aaltjes 14, en vliegt 15,16. Gezien het belang van de rol van lipide druppels in menselijke stofwisselingsziekten, druppeltjes zijn ook geïsoleerd uit gekweekte dierlijke cellen en eenNimal weefsels. Gekweekte cellijnen 3T3-L1 adipocyten 17, Chinese hamster ovarium (CHO)-cellen K2 18, humane hepatocyten 19,20 en epitheliale cellijnen 21 opgenomen. Dierlijke weefsels waaruit druppeltjes zijn geïsoleerd zijn muis skeletspieren 22, 23 lever en borstklieren 23 inbegrepen. Zoals hierboven vermeld, het doel van de meeste druppel isolatie studies is proteoomanalyse voeren op de afhankelijke factoren en lipiden analyse van de neutrale en fosfolipiden.
Sinds neutrale lipiden – de meest talrijke onderdeel van lipide druppels – zijn minder dicht dan de meeste andere cellulaire materialen, heeft isolatie van druppeltjes traditioneel met dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Die techniek is het middelpunt van beide desinfectantia hier gepresenteerd. Vorige technieken 6,24 worden gecombineerd en bewerkt tot een visuele presentatie van de isolatie van druppeltjes uit gekweekte kernsplijting gistcellenen noncultured menselijke cellen verkregen van placenta weefsel. Het doel is de brede toepasbaarheid van deze techniek zien door te kiezen twee sterk verschillende celtypes als uitgangspunten voor de druppel isolatie. Deze techniek moet nuttig zijn voor diegenen die druppels van de meeste organismen te isoleren.
Protocol 1 beschrijft de isolatie van lipide druppeltjes uit de splijtgist, Schizosaccharomyces pombe, die is gebruikt als een model voor het waarnemen druppelvorming in eukaryote celdeling 25. De gist Saccharomyces cerevisiae is uitgebreid gebruikt als modelorganisme voor het bestuderen van lipide druppel biologie. Protocol nr. 1 is van toepassing op zowel organismen en verschillen in de voorbereidingen worden gemarkeerd.
Protocol 2 beschrijft de isolatie van lipide druppeltjes uit placenta villous cellen, die op hun beurt verkregen uit menselijk term placenta. Decollectie term placenta's biedt een unieke gelegenheid om 200-250 g beschikbaar menselijk weefsel 26, die aanzienlijke aantallen lipide druppels bevat veilig en ethisch te verkrijgen. Dit in tegenstelling tot de meeste lipide druppel isolatie werken in hogere eukaryoten waar de druppels afkomstig uit gekweekte cellen. In deze studies worden vetzuren vaak toegevoegd aan de kweek tot de synthese van neutrale lipiden en daarmee de groei van druppeltjes te bevorderen. Dit in tegenstelling tot de werk hier waar lipide druppeltjes worden gevormd onder natuurlijke omstandigheden in placentaweefsel.
De zuiverheden van het lipide druppel fracties worden bepaald door Western blot analyse onder toepassing organel marker antilichamen. Deze twee protocollen lipide druppel fracties die geschikt zijn voor daaropvolgende proteomische en lipiden analyse opleveren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen binnen dit protocol
Zorg overeenstemming met media en celdichtheden te zijn bij de groei van gekweekte cellen. Cellular lipidedruppeltjes zijn uniek omdat hun geassocieerde eiwitten zijn sterk afhankelijk van de omgeving waarin de cellen worden gekweekt 17. Daarom moet het medium waarin de cellen worden gekweekt en de dichtheid van de cellen nauwkeurig gecontroleerd vóór lyse.
De eiwitsamenste…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association award 13SDG14500046 naar PD, een Sustainable Energy Education & Research Center Award (Univ. van Tennessee) tot PD, en door de Physicians 'Medisch Onderwijs en Research Foundation (Univ. van Tennessee) award aan JM De auteurs danken Caroline Leplante (Yale Univ.) voor het protocol voor het omzetten splijtgist om sferoplasten; Eric T. Boder (Univ. van Tennessee) voor het gebruik van zijn schudden incubators, tafelblad centrifuge, en Western Blot analyse apparatuur, en het Centrum voor Milieubiotechnologie (Univ. Tennessee) voor het gebruik van hun ultra-centrifuge, Günther Daum voor gist antilichamen (Graz University of Technology, Oostenrijk.), het personeel van de afdeling Obstetrie en Gynaecologie (Univ. Tennessee Medisch Centrum) voor technische bijstand .
Materials
| PROTOCOL #1: | |||
| 1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 liter glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 liter flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| PROTOCOL #2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine science tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine science tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine science tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml beakers | |||
| 15 ml centrifuge tubes | |||
| 10 ml serological pipettes | |||
| 50 ml centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5000 |
| NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| primary antibodies for PROTOCOL #1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| primary antibodies for PROTOCOL #2 | |||
| perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| calnexin | Cell Signaling technology | 2679 | dilution 1:1000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling technology | 4850 | dilution 1:1000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
Referências
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
