בידוד של טיפות שומנים נייד: שתי טכניקות טיהור החל מתאי שמרים ושליות אדם
Summary
שתי טכניקות לבידוד טיפות שומנים סלולריות מ1) תאי שמרים ו2) שליות אדם מוצגות. במרכזו של שני ההליכים הוא צנטריפוגה שיפוע הצפיפות, שבו השכבה הצפה וכתוצאה מכך המכילה טיפות ניתן דמיינו בקלות על ידי העין, שחולצה, ולכמת על ידי ניתוח כתם מערבי לטוהר.
Abstract
טיפות שומנים הן דינמיים אברונים שניתן למצוא ברוב התאים פרוקריוטים אוקריוטים ומסוימים. מבחינה מבנית, הטיפות מורכבות מליבה של שומנים ניטראליים מוקפים monolayer פוספוליפידים. אחת הטכניקות שימושיות ביותר בקביעת התפקידים הסלולריים של טיפות כבר זיהוי proteomic של חלבונים קשורים, שיכול להיות מבודד יחד עם הטיפות. הנה, שתי שיטות מתוארות לבודד טיפות שומנים וחלבונים הקשורים שלהם משני אאוקריוטים רחבים היקף: שמרי ביקוע ותאי villous שליה אנושיים. אף שיש שני השיטות הבדלים, השיטה העיקרית – צנטריפוגה שיפוע צפיפות – משותפת לשני הכנות. זה מראה את התחולה רחבה של טכניקות בידוד אגל שהוצגו.
בפרוטוקול הראשון, תאי שמרים מומרים לspheroplasts ידי עיכול אנזימטי של קירות התא שלהם. אז spheroplasts כתוצאה מכך הם גנטly lysed בhomogenizer רפוי. Ficoll מתווסף lysate לספק שיפוע צפיפות, ואת התערובת centrifuged שלוש פעמים. אחרי הראשון הספין, טיפות השומנים הם מקומיים לשכבת ציפה בצבע הלבנה של צינורות צנטריפוגה יחד עם reticulum endoplasmic (ER), קרום הפלזמה, ווקואולות. שני ספינים שלאחר מכן משמשים להסרת שלושת אברונים אחרים אלה. התוצאה היא שכבה שיש לו רק טיפות וחלבונים קשורים.
בפרוטוקול השני, תאי שליה villous מבודדים משליות טווח אדם על ידי עיכול אנזימטי עם טריפסין וDNase I. התאים הומוגני בhomogenizer רפוי. צעדים במהירות נמוכה ובינונית צנטריפוגה במהירות משמשים להסרת תאים רצופים, פסולת תאית, גרעינים, ומיטוכונדריה. סוכרוז מתווסף homogenate לספק שיפוע צפיפות והתערובת היא centrifuged להפריד את טיפות השומנים מcellula האחרותשברים r.
טוהר טיפות השומנים בשני הפרוטוקולים אושר על ידי ניתוח כתם מערבי. ברי הטיפה משני preps מתאימים לניתוח proteomic וlipidomic שלאחר מכן.
Introduction
טיפות שומנים סלולריים הן אברונים דינמיים המשרתים פונקציות רבות בתאים. הם רכזות אחסון שומנים ניטראליים, הניתן להמרה לאנרגיה או משמשים לסינתזת פוספוליפידים. הטיפות ממלאות תפקידים מרכזיים במצבים פיסיולוגיים ופתולוגיים כוללים טרשת עורקים, השמנת יתר ומחלות מטבוליות בנושא, וגם במחלות זיהומיות 1,2. בנוסף, הם מקורות מסקרן עבור דלק ביו דיזל.
מידע רב על התפקידים הסלולריים של טיפות שומנים כבר מתקבל מניתוח proteomic וlipidomic של טיפות מטוהרים מאורגניזמים רחבי היקף 3. אורגניזמים אלה כללו חיידקים 4,5, שמרי 6-11, שותלים 12,13, נמטודות 14, ועף 15,16. לאור ההתעניינות בתפקיד של טיפות שומנים במחלות מטבוליות אדם, טיפות יש גם מבודדות מהתאים של בעלי חיים מתורבתים ורקמות nimal. שורות תאים בתרבית כללו adipocytes 3T3-L1 17, תאי K2 השחלה אוגר סיני (CHO) 18, hepatocyes האנושי 19,20, ושורות תאי אפיתל 21. רקמות בעלי החיים שממנו הטיפות היו מבודדות כללו עכבר שרירי שלד 22, כבד 23, ובלוטות החלב 23. כאמור, המטרה של רוב מחקרי בידוד רביב היא לבצע ניתוח proteomic בגורמים קשורים וניתוח lipidomic על ניטראלי ופוספוליפידים.
מאז שומנים ניטראליים – המרכיב רב ביותר של טיפות שומנים – הם פחות צפופים מרוב החומרים תאיים אחרים, בידוד של טיפות באופן מסורתי מתבצע באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות. טכניקה זו היא במרכזו של שני preps שהוצג כאן. טכניקות קודמות 6,24 משולבות והותאמו למצגת חזותית של הבידוד של טיפות מתאי שמרי ביקוע תרבותייםותאים אנושיים noncultured מתקבלים מרקמת שליה. המטרה היא להראות את תחולתה הרחבה של טכניקה זו על ידי בחירה בשני סוגים שונים בהרבה תא כהחל נקודות עבור בידוד רביב. טכניקה זו צריכה להיות שימושית לכל מי שרוצה לבודד את טיפות מרוב האורגניזמים.
פרוטוקול 1 מתאר את הבידוד של טיפות שומנים משמרי הביקוע, pombe Schizosaccharomyces, אשר שימשו כמודל להתבוננות היווצרות טיפה במהלך חלוקת תא אוקריוטים 25. שמרי ניצני שמר אפייה כבר נעשה שימוש נרחב כאורגניזם מודל ללימוד ביולוגיה אגל שומנים בדם. פרוטוקול 1 הוא ישים שני אורגניזמים והבדלים בהכנות מודגשים.
פרוטוקול 2 מתאר את הבידוד של טיפות שומנים מתאי villous שליה, אשר בתורו המתקבל משליות טווח אנושי.אוסף של שליות טווח מספק הזדמנות ייחודית בצורה בטוחה ואתי כדי להשיג 200-250 גרם של רקמה זמינה אדם 26, המכילה מספר משמעותי של טיפות שומנים. זאת בניגוד למרבית עבודות בידוד טיפת שומנים באאוקריוטים גבוהים יותר שבו טיפות מקורן תאים בתרבית. במחקרים אלה, חומצות שומן מתווספות לעתים קרובות לתרבות כדי לקדם את הסינתזה של שומנים ניטראליים ובכך הצמיחה של טיפות. זאת בניגוד לעבודה כאן שבו טיפות שומנים נוצרות בתנאים מקומיים ברקמת שליה.
Purities של השברים טיפת שומנים בדם נקבעת על ידי ניתוח הכתם המערבי באמצעות נוגדני סמן אברון. שני פרוטוקולים אלה יניבו שברים אגל שומנים המתאימים לניתוח proteomic וlipidomic שלאחר מכן.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול זה
הפוך להיות עקבי עם תקשורת וצפיפות תאים במהלך הצמיחה של תאים בתרבית בטוח. טיפות שומנים נייד הן ייחודיות בכך שהחלבונים הקשורים שלהם תלויים במידה רבה על הסביבה שבה התאים 17 בתרב…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הפרס איגוד לב האמריקאי 13SDG14500046 לפ"ד, חינוך בר קיימא באנרגיה ומחקר מרכז פרס (אוניברסיטת טנסי) לפ"ד, ועל ידי החינוך הרפואי 'הרופאים וקרן מחקר (אוניברסיטת טנסי) הפרס לג' מחברים מודים קרוליין Leplante (ייל Univ.) לפרוטוקול להמרת שמרי ביקוע לspheroplasts; אריק ט Boder (אוניברסיטת טנסי) לשימוש בחממות שלו רועדות, צנטריפוגה שולחן, וציוד ניתוח כתם המערבי, והמרכז עבור הסביבה ביוטכנולוגיה (אוניברסיטת טנסי) לשימוש באולטרה צנטריפוגה; גינטר דאום לשמרי נוגדנים (גראץ אונ טכנולוגי, אוסטריה.); כוח האדם של המחלקה למיילדות וגניקולוגיה (המרכז רפואי טנסי Univ.) לקבלת סיוע טכני .
Materials
| PROTOCOL #1: | |||
| 1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 liter glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 liter flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| PROTOCOL #2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine science tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine science tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine science tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml beakers | |||
| 15 ml centrifuge tubes | |||
| 10 ml serological pipettes | |||
| 50 ml centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5000 |
| NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| primary antibodies for PROTOCOL #1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| primary antibodies for PROTOCOL #2 | |||
| perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| calnexin | Cell Signaling technology | 2679 | dilution 1:1000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling technology | 4850 | dilution 1:1000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
Referências
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
