細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術
Summary
1つの細胞の脂質滴を単離するための技術）は、酵母細胞および2）ヒト胎盤が提示される。両方の手順は、液滴の中心を含有する得られた浮遊層が容易に、眼によって視覚化抽出し、純度についてウェスタンブロット分析によって定量化することができる密度勾配遠心分離である。
Abstract
脂肪滴は、ほとんどの真核および特定の原核細胞で見つけることができる動的な細胞小器官である。構造的には、液滴は、リン脂質単分子膜に囲まれた中性脂質のコアで構成されています。液滴の細胞の役割を決定する際に最も有用な技術の1つは、液滴と共に単離することができ、結合したタンパク質のプロテオーム同定されている。分裂酵母とヒト胎盤絨毛細胞：ここでは、二つの方法が2幅広い真核生物からの脂肪滴とその結合したタンパク質を分離するために記述されている。両方の技術は、違いがありますが、mainメソッド – 密度勾配遠心分離を – 両方の製剤で共有されている。これは、提示された液滴分離技術の広い適用可能性を示している。
第一のプロトコルにおいて、酵母細胞は、その細胞壁の酵素消化によって、スフェロプラストに変換される。結果としてフェロプラストはその後紳士ですLYゆったりホモジナイザーで溶解。フィコール密度勾配を提供するために、溶解物に添加し、そして混合物を3回遠心分離する。第一のスピンの後、脂質滴は、小胞体（ER）、原形質膜、および液胞と共に遠心分離管の白色フローティング層に局在している。二つの連続スピンはこれらの他の3小器官を除去するために使用される。結果は滴と結合したタンパク質を持っている層である。
第二のプロトコルでは、胎盤絨毛細胞は、細胞がゆったりホモジナイザーでホモジナイズするトリプシンで酵素消化によりヒト満期胎盤から単離され、DNA分解酵素Iをされています。低速·中速遠心分離工程は、未破壊細胞、細胞破片、核、ミトコンドリアを除去するために使用される。スクロース密度勾配を提供するために、ホモジネートに添加し、混合物を他の蜂巣から脂質滴を分離するために遠心分離されるR画。
両方のプロトコルにおける脂肪滴の純度は、ウェスタンブロット分析によって確認される。両方の調製物からの液滴画分は、その後のプロテオームとlipidomic分析に適している。
Introduction
細胞の脂質滴は、細胞内で複数の機能を果たす動的小器官である。それらはエネルギーに変換またはリン脂質合成のために使用することができる中性脂質の貯蔵のハブである。液滴は、アテローム性動脈硬化症、肥満症および関連する代謝疾患を含む生理学的および病理学的状態において中心的役割を果たし、また、感染症1,2。さらに、それらは、バイオディーゼル燃料のための魅力的な供給源である。
脂肪滴の細胞の役割に関する多くの情報は、幅広い生物3から精製された液滴のプロテオミクスおよびlipidomic分析から得られている。これらの生物は、細菌4,5、酵母6-11含ま12,13植物、14を線虫、そして15,16飛ぶました。ヒトの代謝性疾患における脂肪滴の役割への関心を考慮すると、液滴はまた、培養動物細胞であり、aから単離されているニマル組織。培養細胞株は、3T3-L1脂肪細胞17、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞K2 18、ヒトhepatocyes 19,20、および上皮細胞系21が含まれている。液滴が単離されたから動物組織は、マウス骨格筋22、肝臓23、及び乳腺23が含まれている。上述したように、ほとんどの液滴の分離の研究の目標は、中性およびリン脂質に結合した因子およびlipidomic分析プロテオーム解析を実行することである。
中性脂質以来 – 脂質滴の最も多い成分は – ほとんどの他の細胞材料よりも緻密であり、液滴の分離は、従来、密度勾配遠心分離を用いて行われた。その手法は、ここで紹介するの両方プレップの目玉です。従来の技術は、培養6,24分裂酵母細胞からの液滴の分離を視覚的に結合され、変更されたおよび胎盤組織から得られたヒト細胞をnoncultured。目標は、液滴分離のための出発点に、2つの非常に異なる細胞型を選択することによって、この技術の広い適用可能性を示すことである。この手法は、ほとんどの生物からの液滴を分離したい方のために有用であるはずである。
プロトコル1は、真核細胞分裂の間に25滴形成を観察するためのモデルとして使用されてきた分裂酵母、 シゾサッカロミセス·ポンベから脂質滴の単離が記載されている。出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、脂質滴生物学を研究するためのモデル生物として広く使用されている。プロトコル1は、生物や強調されている準備の違いの両方に適用可能である。
プロトコル2は、ヒト満期胎盤から得た順にある胎盤絨毛細胞から脂肪滴の単離を記載している。ザ·満期胎盤のコレクションは、安全かつ倫理的に脂肪滴のかなりの数が含まれ、容易に入手可能なヒト組織26、200〜250を得するユニークな機会を提供します。これは、液滴が培養された細胞に由来高等真核生物における最も脂肪滴分離作業とは対照的である。これらの研究では、脂肪酸は、多くの場合、中性脂質の合成、従って、液滴の成長を促進する培養物に添加される。これは、脂質滴を、胎盤組織中の天然の条件下で形成される、ここでの作業とは対照的である。
脂肪滴の画分の純度は、細胞小器官マーカー抗体を用いたウェスタンブロット分析によって決定される。これら2つのプロトコルが、後続のプロテオームとlipidomic分析するのに適した脂肪滴画分が得られる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの中の重要なステップ
培養細胞の成長中のメディアと細胞密度と一致していることを確認します。細胞の脂質滴はそれらに関連するタンパク質は、細胞が17培養された環境に大きく依存している点で独特である。したがって、細胞が成長する培地と細胞の密度は、密接に溶解する前に監視されるべきである。
<p cl…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、PDにし、JM低から医師の医療教育研究財団（テネシー大学）賞で持続可能なエネルギー教育研究センター賞（テネシー大）、PDに米国心臓協会賞13SDG14500046によってサポートされていました彼の揺れインキュベーター、卓上遠心、およびウエスタンブロット分析装置の使用のためにエリック·T. Boder（テネシー大学）;、著者らは、フェロプラストに分裂酵母を変換するためのプロトコルのためにキャロラインLeplante（エール大学）に感謝し、センター彼らの超遠心機を使用するための環境バイオテクノロジー（東大テネシー州）、酵母抗体についてのギュンター·ダウム（グラーツ大学技術、オーストリア）;技術支援のための産婦人科（東大テネシー州の医療センター）の職員。
Materials
| PROTOCOL #1: | |||
| 1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 liter glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 liter flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| PROTOCOL #2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine science tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine science tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine science tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml beakers | |||
| 15 ml centrifuge tubes | |||
| 10 ml serological pipettes | |||
| 50 ml centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5000 |
| NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| primary antibodies for PROTOCOL #1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| primary antibodies for PROTOCOL #2 | |||
| perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| calnexin | Cell Signaling technology | 2679 | dilution 1:1000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling technology | 4850 | dilution 1:1000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
Referências
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
