Isolering av Cellular lipid dråper: To rensing teknikker Starter fra gjærceller og menneske Placentas
Summary
To teknikker for å isolere celle lipid dråper fra 1) gjær-celler og 2) humane placentas presenteres. Midtpunktet i begge fremgangsmåter er tetthetsgradient-sentrifugering, der den resulterende flytende lag som inneholder dråpene kan lett visualiseres ved øyet, ekstrahert og kvantifisert ved Western Blot analyse for renhet.
Abstract
Lipid dråper er dynamiske organeller som finnes i de fleste eukaryote og enkelte prokaryote celler. Strukturelt dråpene består av en kjerne av nøytrale lipider som er omgitt av et fosfolipid monolayer. En av de mest nyttige metoder for å bestemme den cellulære rollene til dråper har vært proteomikk identifisering av bundne proteiner, som kan bli isolert sammen med dråpene. Her er to metoder beskrevet å isolere lipid dråper og deres bundne proteiner fra to omfattende eukaryoter: fisjon gjær og menneskelige placenta villous celler. Selv om begge metoder har forskjeller, den viktigste metode – densitetsgradient sentrifugering – er felles for begge preparater. Dette viser den brede anvendbarhet av de presenterte dråpeisolasjonsteknikker.
I den første protokollen, er gjærceller omdannet til sfæroplaster ved enzymatisk fordøyelse av celleveggene. De resulterende sfæroplaster blir deretter gently lysert i en løstsittende homogenisator. Ficoll tilsettes til lysatet for å tilveiebringe en densitets-gradient, og blandingen ble sentrifugert tre ganger. Etter den første sentrifugering, blir lipid dråper lokalisert til hvitfarget flytende sjikt av sentrifugerør sammen med det endoplasmatiske retikulum (ER), plasmamembranen, og vakuoler. To påfølgende spinn brukes til å fjerne disse tre andre organeller. Resultatet er et lag som bare har små dråper og bundne proteiner.
I den andre protokollen, placental villous celler isoleres fra humant sikt placentas ved enzymatisk spalting med trypsin og DNase I. Cellene ble homogenisert i en løstsittende homogenisator. Lav hastighet og middels hastighet sentrifuge trinn brukes til å fjerne ubrutt celler, cellerester, atomkjerner, og mitokondrier. Sukrose blir tilsatt til homogenatet til å tilveiebringe en densitets-gradient, og blandingen sentrifugeres for å separere lipid-dråper fra den andre mobilnettetr fraksjoner.
Renheten av de lipid-dråper i begge protokoller blir bekreftet ved Western Blot analyse. Den dråpe fraksjoner fra begge preps er egnet for etterfølgende proteomikk og lipidomiske analyse.
Introduction
Cellular lipid dråper er dynamiske organeller som viser flere funksjoner i cellene. De er lagrings nav for nøytrale lipider, som kan konverteres til energi eller brukes for fosfolipidsyntese. Dråpene spille sentrale roller i fysiologiske og patologiske tilstander, inkludert aterosklerose, fedme og relaterte metabolske sykdommer, og også smittsomme sykdommer 1,2. I tillegg er de interessante kilder for biodieseldrivstoff.
Mye informasjon om de cellulære roller lipid dråper er innhentet fra proteomikk og lipidomiske analyse av dråper renset fra vidtrekkende organismer 3. Disse organismene har tatt bakterier 4,5, gjær 6-11, planter 12,13, nematoder 14, og flyr 15,16. På grunn av interessen for rollen til lipid dråper i humane metabolske sykdommer, har dråpene også blitt isolert fra dyrkede dyreceller og enNimal vev. Dyrkede cellelinjer har tatt 3T3-L1 celler 17, kinesisk hamster eggstokk (CHO) K2 celler 18, menneskelige hepatocyes 19,20, og epiteliale cellelinjer 21. Animalsk vev fra hvilke dråper har vært isolert har inkludert mus skjelettmuskulaturen 22, lever-23, og brystkjertlene 23. Som nevnt ovenfor, er målet for de fleste dråpe isolasjon studier for å utføre proteomikk analyser på de bundne faktorer og lipidomiske analyse på den nøytrale og fosfolipider.
Siden nøytrale lipider – den mest tallrike komponent av lipid dråper – er mindre tett enn de fleste andre cellulære materialer, og isolering av dråper tradisjonelt blitt utført ved hjelp av tetthetsgradient-sentrifugering. At teknikken er midtpunktet i begge forbereder presenteres her. Tidligere teknikker 6,24 kombineres og modifiseres på en visuell presentasjon av isolering av dråper fra dyrkede fisjonsgjærcelleneog noncultured menneskelige celler hentet fra placenta vev. Målet er å vise den brede anvendelsen av denne teknikken ved å velge to vidt forskjellige celletyper som startpunkter for dråpe isolasjon. Denne teknikken bør være nyttig for de som ønsker å isolere dråper fra de fleste organismer.
Protokoll 1 beskriver isolering av lipid-dråper fra fisjons gjær, Schizosaccharomyces pombe, som har blitt benyttet som en modell for å observere dråpedannelse under eukaryot celledelingen 25.. Den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae har blitt brukt mye som modellorganisme for å studere oljedråpe biologi. Protokoll 1 er gjeldende for både organismer og forskjeller i forberedelsene er uthevet.
Protokoll 2 beskriver isolering av lipid-dråper fra placenta villous celler, som er i sin tur oppnådd fra human sikt placentas. Densamling av begrepet placentas gir en unik mulighet til trygt og etisk få 200-250 g lett tilgjengelig menneskelig vev 26, som inneholder betydelige mengder lipid dråper. Dette er i motsetning til de fleste oljedråpe isoleringsarbeidet i høyere eukaryoter, hvor dråpene kommer fra dyrkede celler. I disse studiene, blir fettsyrene ofte tilsatt til kulturen for å fremme syntesen av nøytrale lipider og dermed vekst av små dråper. Dette er i motsetning til det arbeide her, hvor lipid-dråper blir dannet i henhold til opprinnelige betingelser i placenta-vev.
Renheter av lipid dråpe fraksjoner bestemmes av Western Blot analyse ved hjelp av organelle markør antistoffer. Disse to protokollene vil gi oljedråpe fraksjoner som er egnet for senere proteomikk og lipidomiske analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trinnene i denne protokollen
Sørg for å være i samsvar med media og celletetthet under vekst av dyrkede celler. Cellular lipid dråper er unike i at deres assosierte proteiner er svært avhengig av miljøet der cellene dyrkes 17. Derfor bør mediet hvor cellene er dyrket og tettheten av cellene overvåkes nøye før lysering.
Proteinet sammensetningen av lipid dråper er en funksjon av vekstfasen av g…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association award 13SDG14500046 til PD, en Sustainable Energy Education & Research Center Award (Univ. of Tennessee) til PD, og av Physicians 'Medical Education and Research Foundation (Univ. of Tennessee) award til JM Forfatterne takker Caroline Leplante (Yale Univ..) for protokollen for å konvertere fisjon gjær til sfæroplaster, Eric T. Boder (Univ. of Tennessee) for bruk av hans risting inkubatorer, bordsentrifuge, og Western Blot analyse utstyr, og Senter for Miljø Bioteknologi (Univ. Tennessee) for bruken av sin ultra-sentrifuger, Günther Daum for gjær antistoffer (Graz Univ. of Technology, Østerrike.), personalet på avdelingen for obstetrikk og gynekologi (Univ. Tennessee Medical Center) for teknisk assistanse .
Materials
| PROTOCOL #1: | |||
| 1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 liter glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 liter flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| PROTOCOL #2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine science tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine science tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine science tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml beakers | |||
| 15 ml centrifuge tubes | |||
| 10 ml serological pipettes | |||
| 50 ml centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5000 |
| NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| primary antibodies for PROTOCOL #1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| primary antibodies for PROTOCOL #2 | |||
| perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| calnexin | Cell Signaling technology | 2679 | dilution 1:1000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling technology | 4850 | dilution 1:1000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
Referências
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
