Выделение сотовых липидные капли: Два Методы очистки Начиная с дрожжевых клеток и правам плаценты
Summary
Два метода для выделения капель сотовой липидов от 1) дрожжевые клетки и 2) человека плаценты представлены. Центральное обеих процедур центрифугирования в градиенте плотности, где в результате плавающий слой, содержащий капельки могут быть легко визуализированы на глаз, экстрагировали и количественно с помощью Вестерн-блот-анализа для чистоты.
Abstract
Липидных капель динамические органеллы, которые можно найти в большинстве эукариотических и некоторых прокариотических клеток. Конструктивно капли состоят из сердцевины нейтральных липидов, окруженных фосфолипидного монослоя. Одним из наиболее полезных методов в определении роли клеточных капель был протеомических идентификация связанные белки, которые могут быть изолированы вместе с капель. Здесь два метода описаны изолировать липидные капли и их связанные белки из двух широких эукариот: дрожжей деления и плацентарные ворсинчатые клеток человека. Хотя оба метода имеют различия, основным методом – градиент плотности центрифугирования – является общим для обоих препаратов. Это показывает широкую применимость представленных методов изоляции капель.
В первом протоколе, дрожжевые клетки преобразуются в сферопластов ферментативным расщеплением их клеточных стенок. Полученные сферопласты то Гентлы лизируют в свободно облегающие гомогенизатора. Ficoll добавляется в лизате, чтобы обеспечить градиент плотности, и полученную смесь центрифугируют в три раза. После первого спина, капли липидов локализованы к белому плавающий слой из центрифужные пробирки вместе с эндоплазматический ретикулум (ER), плазматической мембране и вакуоли. Два последующих спины используются для удаления этих трех других органелл. Результатом является слой, который имеет только капли и связанные белки.
Во второй схеме, плацентарные ворсинчатые клетки выделяют из человеческой плаценты срок ферментативным расщеплением трипсином и ДНКазой I. Клетки гомогенизируют в свободно облегающие гомогенизатора. Низкая скорость и средней скорости центрифугирования шаги используются для удаления неразрушенных клеток, продукты распада клеток, ядер и митохондрий. Сахароза добавляется в гомогенате, чтобы обеспечить градиент плотности и центрифугируют, чтобы отделить липидных капель с другой CELLULAг фракции.
Чистоту липидных капелек в обоих протоколов подтверждена с помощью Вестерн-блот-анализа. Капли фракции из обоих Preps подходят для последующей протеомного и липидомных анализа.
Introduction
Капли Сотовый липидов являются динамическими органеллы, которые служат несколько функций в клетках. Они концентраторы для хранения нейтральных липидов, которые могут быть конвертированы в энергию или используемых для синтеза фосфолипидов. Капли играют центральную роль в физиологических и патологических состояний, включая атеросклероз, ожирение и связанные с метаболическими заболеваниями, а также инфекционные заболевания 1,2. Кроме того, они интригуют источники биодизельного топлива.
Много информации на клеточном роли липидных капель, была получена из протеомного и липидомных анализа капель очищенных от широкомасштабных организмов 3. Эти организмы включили бактерий 4,5, дрожжи 6-11, растения 12,13, нематоды 14, и летит 15,16. Учитывая интерес в роли липидных капелек в метаболических заболеваний человека, капли были также выделены из культивируемых клеток животного иНимал тканей. Культивируемые клеточные линии были включены 3T3-L1 адипоцитах 17, яичника китайского хомячка (CHO) клетки K2 18, человеческие hepatocyes 19,20 и эпителиальные клеточные линии 21. Животных тканей, из которого капли были выделены включали мыши скелетных мышц, печени 22 23 и молочных желез 23. Как упоминалось выше, цель большинстве исследований изоляции капель является выполнение протеомного анализа на связанных факторов и липидомных анализа на нейтральный и фосфолипидов.
Поскольку нейтральные липиды – самая многочисленная составляющая липидных капель – менее плотная, чем большинство других сотовых материалов, изоляция капель традиционно выполняется с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Этот метод является центральным обоих Preps представленных здесь. Предыдущие методы 6,24 объединены и изменены в визуального представления изоляции капель из культивируемых деления дрожжевых клетоки noncultured человеческие клетки получены из плацентарной ткани. Цель состоит в том, чтобы показать широкой применимости этого метода, выбирая два совершенно разных типов клеток в качестве исходных точек для выделения капель. Эта техника должна быть полезной для тех, кто желает, чтобы изолировать капли от большинства организмов.
Протокол 1 описывается изоляция липидных капель с делящихся дрожжей, Schizosaccharomyces РотЬе, который был использован в качестве модели для наблюдения образование капель при эукариотической деления клеток 25. Подающая надежды дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE широко используется в качестве модельного организма для изучения липидного капель биологию. Протокол 1 применим как организмов и различия в подготовке выделены.
Протокол 2 описывается изоляция липидные капли от плацентарных ворсинок клеток, которые в свою очередь полученного из человеческой плаценты срок.Коллекция срочных плаценты дает уникальную возможность безопасно и этично получить 200-250 г легкодоступной ткани человека 26, который содержит значительное количество липидных капель. Это в отличие от большинства изоляции липидов капли работы в высших эукариот, где капельки происходят из культивируемых клеток. В этих исследованиях, жирные кислоты часто добавляют в культуры для содействия синтез нейтральных липидов и, следовательно, роста капель. Это в отличие от работы здесь, где липидные капли образуются при нативных условиях в плацентарной ткани.
В чистоты липида фракций капель определяются с использованием органелл маркерные антитела, с помощью анализа вестерн-блоттинга. Эти два протокола даст липидов капель фракций, которые подходят для последующей протеомного и липидомных анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в рамках этого протокола
Убедитесь, чтобы быть совместимыми с сред и плотности клеток в процессе роста культивируемых клеток. Клеточные капли липидов являются уникальными в том, что их соответствующие белки сильно зависит от сред?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Американская Ассоциация Сердца награждения 13SDG14500046 к PD, устойчивое энергетическое образования и исследовательского центра Award (Университет Теннесси) с БП, и Врачей медицинского образования и исследований Фонда (Университет Теннесси) награда JM The Авторы выражают благодарность Caroline Leplante (Йельский университет) для протокола для преобразования деления дрожжей сферопластов; Эрик Т. Boder (Университет Теннесси) за использование дрожащими инкубаторов, настольной центрифуге и аналитического оборудования иммуноблота; и Центр Экологическая биотехнология (Университет Теннесси) для использования их ультра-центрифуги; Гюнтер Даум для дрожжевых антител (Грац ун-т технологии, Австрия.); личный состав кафедры акушерства и гинекологии (Университет Теннесси Medical Center) для оказания технической помощи .
Materials
| PROTOCOL #1: | |||
| 1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 liter glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 liter flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| PROTOCOL #2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine science tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine science tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine science tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml beakers | |||
| 15 ml centrifuge tubes | |||
| 10 ml serological pipettes | |||
| 50 ml centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5000 |
| NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| primary antibodies for PROTOCOL #1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| primary antibodies for PROTOCOL #2 | |||
| perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| calnexin | Cell Signaling technology | 2679 | dilution 1:1000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling technology | 4850 | dilution 1:1000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
Referências
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
