Isolering av Cellular Lipid Droppar: Två reningstekniker Betyg från jästceller och mänskliga moderkakor
Summary
Två tekniker för att isolera cellulära lipiddropparna från 1) jästceller och 2) mänskliga moderkakor presenteras. Det viktigaste i båda förfarandena är densitetsgradientcentrifugering, där den resulterande flytande lager som innehåller dropparna kan lätt visualiseras genom ögat, extraherade, och kvantifieras med Western blot-analys för renhet.
Abstract
Lipiddropparna är dynamiska organeller som finns i de flesta eukaryota och vissa prokaryota celler. Strukturellt dropparna består av en kärna av neutrala lipider som omges av en fosfolipid-monoskikt. En av de mest användbara tekniker i att bestämma de cellulära roller dropparna har varit proteomic identifiering av bundna proteiner, som kan isoleras tillsammans med de små dropparna. Här är två metoder som beskrivs för att isolera lipiddropparna och deras bundna proteiner från två omfattande eukaryoter: fission jäst och mänskliga placenta villösa celler. Även om båda teknikerna har skillnader, den viktigaste metoden – densitetsgradientcentrifugering – delas av de båda preparaten. Detta visar den breda tillämpningen av de presenterade droppisoleringstekniker.
I det första protokollet, är jästceller omvandlas till sfäroplasterna genom enzymatisk nedbrytning av deras cellväggar. De erhållna sfäroplaster därefter gently lys i en löst sittande sator. Ficoll tillsättes till lysatet för att ge en densitetsgradient, och blandningen centrifugerades tre gånger. Efter den första spin är de lipiddropparna lokaliserad till vitfärgad flytande skikt av centrifugrören tillsammans med det endoplasmatiska retiklet (ER), plasmamembranet, och vakuoler. Två efterföljande snurrar används för att ta bort dessa tre andra organeller. Resultatet är ett skikt som har endast droppar och bundna proteiner.
I det andra protokollet, är moderkakan villösa celler som isolerats från mänsklig sikt ntas genom enzymatisk spjälkning med trypsin och DNas I. Cellerna homogeniseras i en löst sittande sator. Låg hastighet och medelhastighetscentrifugeringssteg används för att avlägsna hela celler, cellrester, cellkärnor, och mitokondrier. Sackaros tillsätts till homogenatet för att ge en densitetsgradient, och blandningen centrifugeras för att separera de lipiddropparna från den andra cellular fraktioner.
Renheten hos lipiddroppar i båda protokollen bekräftas genom Western blot-analys. Droppen fraktionerna från båda preps är lämpliga för efterföljande proteomic och lipidomic analys.
Introduction
Cellulär lipiddropparna är dynamiska organeller som behandlar flera funktioner i celler. De är förvarings nav för neutrala lipider, som kan omvandlas till energi eller används för fosfolipid syntes. Dropparna spelar centrala roller i fysiologiska och patologiska tillstånd innefattande ateroskleros, fetma och metaboliska sjukdomar, och även infektionssjukdomar 1,2. Dessutom, de är spännande källor för biodieselbränslen.
Mycket information om de cellulära roller lipiddropparna har erhållits från proteomik och lipidomic analys av droppar som renats från omfattande organismer 3. Dessa organismer har inkluderat bakterier 4,5, jäst 6-11, växter 12,13, nematoder 14, och flyger 15,16. Med tanke på intresset av rollen av lipiddroppar i humana metaboliska sjukdomar, har dropparna också isolerats från odlade djurceller och ennimal vävnader. Odlade cellinjer har inkluderat 3T3-L1 adipocyter 17, kinesisk hamsterovarie-(CHO)-K2-celler 18, mänskliga hepatocyes 19,20 och epitelcellinjer 21. Djurvävnader som droppar har isolerats har inkluderat musen skelettmuskel 22, lever 23, och bröstkörtlar 23. Såsom nämnts ovan är målet för de flesta droppisoleringsstudier att utföra proteomic analys på de bundna faktorer och lipidomic analys på den neutrala och fosfolipider.
Eftersom neutrala lipider – den mest talrika komponent av lipiddropparna – är mindre tät än de flesta andra cellulära material, har isolering av droppar som traditionellt utförts med hjälp av densitetsgradientcentrifugering. Denna teknik är mittpunkten i båda preps presenteras här. Tidigare tekniker 6,24 kombineras och modifieras till en visuell presentation av isoleringen av droppar från odlade fissionsjäst celleroch noncultured humana celler erhållna från placenta-vävnad. Målet är att visa den breda tillämpligheten av denna teknik genom att välja två väldigt olika celltyper som utgångspunkter för dropp isolering. Denna teknik bör vara användbart för den som vill isolera droppar från de flesta organismer.
Protokoll 1 beskriver isolering av lipiddroppar från fissionsjäst, Schizosaccharomyces pombe, som har använts som en modell för att observera droppbildning under eukaryotisk celldelning 25. Den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae har använts i stor utsträckning som modellorganism för att studera fettdropp biologi. Protokoll 1 gäller för både organismer och skillnader i förberedelserna är markerade.
Protokoll 2 beskriver isolering av blodfettdroppar från placental villösa celler, som i sin tur är erhållen från humant Undersökningar moderkakor. Deninsamling av långsiktiga placentas ger en unik möjlighet att på ett säkert och etiskt få 200-250 g lättillgängliga mänsklig vävnad 26, som innehåller ett stort antal fettdroppar. Detta är i motsats till de flesta lipid droplet isolering arbete i högre eukaryoter, där dropparna kommer från odlade celler. Under dessa studier används fettsyror ofta tillsätts till odlings att främja syntesen av neutrala lipider och därmed tillväxten av små droppar. Detta är i motsats till det arbete här där lipid droppar bildas under nativa betingelser i placenta-vävnad.
De renheter av lipiden dropp fraktionerna bestämdes genom Western blot-analys med användning av organell markörantikroppar. Dessa två protokollen kommer att ge lipid droplet fraktioner som är lämpliga för efterföljande proteomic och lipidomic analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg i detta protokoll
Se till att vara konsekvent med media och celldensiteter under tillväxt av odlade celler. Cellulära lipiddropparna är unika i att de har associerade proteiner är i hög grad beroende av den omgivning i vilken cellerna odlas 17. Därför bör mediet i vilket cellerna odlas och densiteten av cellerna övervakas noggrant före lys.
Proteinsammansättningen av lipiddroppar är en f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av American Heart Association utmärkelse 13SDG14500046 till PD, en hållbar energi Education & Research Center Award (Univ. of Tennessee) till PD, och av läkare "medicinsk utbildning och forskning Foundation (Univ. of Tennessee) utmärkelse till JM Författarna tackar Caroline Leplante (Yale Univ..) för protokollet för konvertering fissionsjäst till sfäroplaster, Eric T. Boder (Univ. of Tennessee) för användning av hans skakande inkubatorer, bordscentrifug och Western Blot-analys utrustning, och Centrum för Environmental Biotechnology (Univ. Tennessee) för användningen av deras ultracentrifug, Günther Daum för jäst antikroppar (Graz Univ. of Technology, Österrike.), personalen vid avdelningen för obstetrik och gynekologi (Univ. Tennessee Medical Center) för att få hjälp .
Materials
| PROTOCOL #1: | |||
| 1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 liter glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 liter flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| PROTOCOL #2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine science tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine science tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine science tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml beakers | |||
| 15 ml centrifuge tubes | |||
| 10 ml serological pipettes | |||
| 50 ml centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5000 |
| NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| primary antibodies for PROTOCOL #1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| primary antibodies for PROTOCOL #2 | |||
| perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| calnexin | Cell Signaling technology | 2679 | dilution 1:1000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling technology | 4850 | dilution 1:1000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
Referências
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
