Hücresel Lipid damlacıklar İzolasyonu: Maya Hücreleri ve insan plasentası itibaren iki Arıtma Teknikleri
Summary
: 1) hücresel lipid damlacıkları izole maya hücreleri ve 2) insan plasenta sunulmuştur için iki teknikleri. Her iki prosedürlerinin merkezinde damlacıkları ihtiva eden elde edilen yüzer tabaka, hali hazırda, göz ile görselleştirilmiştir ekstre edilmiş ve saflık için Western Blot analizi ile tayin edilebilir yoğunluk gradyan santrifüj vardır.
Abstract
Lipid damlacıkları en ökaryotik ve prokaryotik hücrelerde bazı bulunabilir dinamik organellerdir. Yapısal olarak, damlacıkları, bir fosfolipid tek tabaka ile çevrilidir nötr lipitlerin bir çekirdekten oluşur. Damlacıkların hücresel rolleri belirlenmesinde en yararlı tekniklerden biri damlacıkları ile birlikte izole edilebilir bağlı proteinler, proteomik tanımlanması olmuştur. Fizyon maya ve insan plasental villöz hücreleri: Burada, iki yöntem, iki geniş ökaryotlardan lipid damlacıkları ve bunların bağlı proteinleri izole etmek için tarif edilmiştir. Her iki teknik farklılıklar olmasına rağmen, ana yöntem – yoğunluk gradyan santrifüj – hem hazırlıkları tarafından paylaşılır. Bu sunulan damlacık izolasyon teknikleri geniş uygulama gösterilmektedir.
İlk protokolde, maya hücreleri, hücre duvarlarının enzimatik sindirme ile spheroplastlar dönüştürülür. Oluşan sferoplastlar sonra Gently bir gevşek homojenizatör içinde eritildi. Ficoll yoğunluk gradyanı sağlamak için lizat ilave edilir ve karışım, üç kez santrifüj edilir. Ilk dönüşü sonra, lipid damlacıkları, endoplazmik retikulum (ER), plazma zarı ve vakuoller ile birlikte santrifüj tüplerine beyaz renkli bir kayan tabakaya lokalizedir. Daha sonraki iki spin bu diğer üç organellere kaldırmak için kullanılır. Sonuç olarak sadece damlacıkları ve bağlanmış proteinler sahip bir tabakadır.
İkinci protokolde, plasenta villöz hücreler tripsin ve DNase I Hücreler, gevşek homojenleştiricide homojenize edilir ile enzimatik sindirme ile insan plasentası terimi izole edilmiştir. Düşük hız ve orta hızlı santrifüj adımları kırılmamış hücreleri, hücresel atıkları, çekirdek ve mitokondri kaldırmak için kullanılır. Sakaroz bir yoğunluk gradyanı sağlamak için homojenat ilave edilir ve karışım, diğer cellula gelen lipid damlacıkları ayırmak için santrifüj edilirr kesirler.
Her iki protokolde de lipid damlacıkları saflığı, Western Blot analizi ile teyit edilir. Her iki preparatlarıyla gelen damlacık fraksiyonlar sonraki proteomik ve lipidomic analiz için uygundur.
Introduction
Hücresel lipid damlacıkları hücrelerinde birden fazla işleve hizmet dinamik organelleri. Bunlar enerjiye dönüştürülür ya da fosfolipid sentezi için kullanılabilir nötr lipidler, depolama merkezleri vardır. Damlacıklar, ateroskleroz, obezite ve ilişkili metabolik hastalıklar da dahil olmak üzere fizyolojik ve patolojik durumlarda merkezi bir rol oynar ve aynı zamanda bulaşıcı hastalıklar 1,2. Buna ek olarak, biyodizel yakıtları için ilgi çekici kaynaklarıdır.
Lipid damlacıkları hücre rolleri hakkında bilgisi geniş organizmalar 3 saflaştırılan damlacıklarının proteomik ve lipidomic analizinden elde edilmiştir. Bu organizmalar, bakteri 4,5, maya 6-11 dahil 12,13 bitkiler, 14 nematodları, ve 15,16 sinekler var. İnsan metabolik hastalıklar lipid damlaları rolü olan ilgi dikkate alındığında, damlacıkları ile kültürden geçirilmiş hayvan hücreleri ve a izole edilmişNimal dokular. Kültürlü hücre çizgileri, 3T3-L1 adipositler 17, Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücreleri 18 K2, insan hepatocyes 19,20 ve epitel hücre hatları 21 dahil ettik. Damlacıklar izole edilmiş olan hayvan dokuları fare iskelet kas 22, karaciğer 23 ve 23 meme bezleri dahil ettik. Yukarıda zikredildiği gibi, en çok damlacık izolasyon çalışmaların amacı bağlı faktör ile nötr ve fosfolipidlerden lipidomic analizine proteomik analiz etmektir.
Nötr lipidler yana – lipid damlacıkları en çok bileşenli – En çok diğer hücre malzemelere nazaran daha az yoğun olan, damlacıkların izolasyon geleneksel yoğunluk gradyan santrifüjlemesi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu tekniği Burada sunulan iki preparatlarıyla merkezinde olduğunu. Önceki teknikler 6,24 kültürlenmiş bölünmüş maya hücrelerinden damlacıklarının izolasyonu bir görsel sunum halinde bir araya getirilmiş ve modifiyeve noncultured insan hücreleri plasenta dokusundan elde edilmiştir. Amaç damlacık izolasyonu için başlangıç noktası olarak, iki çok farklı hücre tiplerini seçerek bu tekniğin geniş uygulanabilirlik göstermektir. Bu teknik çoğu organizmalar damlacıkların izole etmek isteyenler için yararlı olacaktır.
Protokol 1 ökaryotik hücre bölünmesi esnasında 25, damlacık oluşumunu gözlemlemek için bir model olarak kullanılmıştır fizyon maya, Schizosaccharomyces pombe, ikinci lipid damlacıkları izolasyonunu tarif eder. Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae lipid damlacık biyoloji eğitimi için bir model organizma olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. Protokol 1 organizmalar ve hazırlıkları farklılıklar hem de uygulanabilir vurgulanır.
Protokol 2 İnsan plasentası terimi, elde edilen sırayla olan plasental villöz hücrelerden lipid damlacıkları izolasyonunu tarif eder.Terim Plasentaların koleksiyonu güvenle ve etik lipid damlacıkları önemli numaralarını içeren hazır insan dokusunda 26, 200-250 g almak için eşsiz bir fırsat sunuyor. Bu damlacıklar kültürlenmiş hücrelerden kaynaklanan daha yüksek ökaryotlarda en lipid damlacık izolasyon çalışma aksine bulunmaktadır. Bu çalışmalarda, yağ asitleri genellikle nötral lipid ve böylece damlacıkların büyümesinin sentezini teşvik etmek için kültüre eklenir. Bu lipid damlacıkları plasental dokudaki doğal koşullar altında oluşturulmaktadır burada çalışma aksine bulunmaktadır.
Lipid damlacık fraksiyonlarının saflıkları organel markör antikorları kullanılarak Western Blot analizi ile belirlenir. Bu iki protokol sonraki proteomik ve lipidomic analiz için uygun olan lipid damlacık kesirler verecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol kapsamında kritik adım
Kültür haline gelmiş hücrelerin büyümesi sırasında ortam ve hücre yoğunlukları ile tutarlı olması için emin olun. Cellular lipid damlacıkları, ilişkili proteinlerin hücreler kültürlendi 17 olduğu çevre üzerine son derece bağımlı olmasıyla benzersizdir. Bu nedenle, hücrelerin yetiştirildiği ortam ve hücre yoğunluğu yakından lizis önce izlenmelidir.
<p class="jove_cont…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Emniyeti'ne Emniyeti'ne Amerikan Kalp Derneği ödül 13SDG14500046, Sürdürülebilir Enerji Eğitim ve Araştırma Merkezi Ödülü (Tennessee Univ.) tarafından desteklenen ve JM için Hekim Tıp Eğitimi ve Araştırma Vakfı (Tennessee Univ.) tarafından ödüllü edildi Onun sallayarak inkübatör, masaüstü santrifüj, ve Western Blot analizi ekipman kullanımı için Eric T. Boder (Tennessee Univ.); yazarlar spheroplastlar için fisyon maya dönüştürmek için protokol için Caroline Leplante (. Yale Üniversitesi) teşekkür ve için Merkezi ultra santrifüj kullanımı için Çevresel Biyoteknoloji (Univ. Tennessee); maya antikorlar Günther Daum (Graz Üniversitesi Teknoloji, Avusturya.); teknik yardım için Kadın Hastalıkları ve Doğum (Univ. Tennessee Tıp Merkezi) Bölümü personel .
Materials
| PROTOCOL #1: | |||
| 1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 liter glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 liter flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| PROTOCOL #2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine science tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine science tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine science tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml beakers | |||
| 15 ml centrifuge tubes | |||
| 10 ml serological pipettes | |||
| 50 ml centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5000 |
| NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| primary antibodies for PROTOCOL #1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| primary antibodies for PROTOCOL #2 | |||
| perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| calnexin | Cell Signaling technology | 2679 | dilution 1:1000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling technology | 4850 | dilution 1:1000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
Referências
- Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
- Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med. 16, 1295-1298 (2010).
- Ding, Y. F., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nat. Protoc. 8, 43-51 (2013).
- Kalscheuer, R., et al. Preparative isolation of lipid inclusions from Rhodococcus opacus and Rhodococcus rubber and identification of granule-associated proteins. Arch. Microbiol. 177, 20-28 (2001).
- Low, K. L., et al. Lipid droplet-associated proteins are involved in the biosynthesis and hydrolysis of triacylglycerol in mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin. J. Biol. Chem. 285, 21662-21670 (2010).
- Leber, R., Zinser, E., Zellnig, G., Paltauf, F., Daum, G. Characterization of lipid particles of the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10, 1421-1428 (1994).
- Grillitsch, K., et al. Lipid particles/droplets of the yeast Saccharomyces cerevisiae revisitied: lipidome meets proteome. Biochim. Biophys. Acta. , 1165-1176 (2011).
- Binns, D., et al. An intimate collaboration between peroxisomes and lipid bodies. J. Cell Biol. 173, 719-731 (2006).
- Ivashov, V. A., et al. Lipidome and proteome of lipid droplets from the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 282-290 (2013).
- Connerth, M., Grillitsch, K., Kofeler, H., Daum, G. Analysis of lipid particles from yeast. Lipidomics: Vol. 1: Methods and Protocols. 579, 359-374 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods Mol. Biol. 457, 151-163 (2008).
- Jolivet, P., et al. Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS. Plant Physiol. Biochem. 42, 501-509 (2004).
- Katavic, V., Agrawal, G. K., Hajduch, M., Harris, S. L., Thelen, J. J. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivers. Proteomics. 6, 4586-4598 (2006).
- Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol. Cell. Proteomics. 11, 317-328 (2012).
- Krahmer, N., Hilger, M., Kory, N., Wilfling, F., Stoehr, G., Mann, M., Farese, R. V., Walther, T. C. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol. Cell Proteomics. 12, 1115-1126 (2013).
- Cermelli, S., Gou, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. The lipid-droplet proteome reveals that droplets are a protein-storage depot. Curr. Biol. 16, 1783-1795 (2006).
- Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).
- Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic. J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).
- Fujimoto, Y., et al. Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7. Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. J. Biochem. 139, 921-930 (2006).
- Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. Association of stomatin with lipid bodies. J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).
- Zhang, H. N., et al. Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I. J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic. 13, 705-714 (2012).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Cho, S. Y., et al. Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets. J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).
- Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse. Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).
- Jagerstrom, S., et al. Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23. Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).
- Xu, N. Y., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).
- Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane. J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).
- Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).
- Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria. Protein Cell. 2, 487-496 (2011).
- Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres. Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).
- Goodman, J. M. The gregarious lipid droplet. J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion. J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).
