リンパ節は免疫応答を調整する免疫組織であり、ワクチンの重要な標的です。バイオマテリアルは、より良いリンパ節を標的とし、抗原またはアジュバントの送達を制御するために採用されてきた。本論文では、これらのアイデアを組み合わせて、生体適合性ポリマー粒子をリンパ節に注入する技術について述べる。
適応免疫応答の生成は、Tリンパ球およびBリンパ球に対するこれらの外来分子の処理および提示のために、リンパ節への抗原の効率的な排出または密売に依存する。リンパ節は、新しいワクチンや免疫療法の重要な標的となっています。これらの組織を標的とする最近の戦略は、可溶性ワクチン成分の直接リンパ節注射であり、この技術を含む臨床試験が有望であった。また、生体物質ワクチン粒子の最適な排水のために粒子径を調整するなど、リンパ節の標的化を改善するためのいくつかの生体材料戦略も検討されている。本論文では、直接リンパ節注射と、抗原、アジュバント、その他のワクチン成分を含む生分解性ポリマー粒子を組み合わせた新しい方法を紹介する。この方法では、高分子微粒子またはナノ粒子は、脂質安定剤を組み込んだ改変二重エマルジョンプロトコルによって合成される。粒子特性(サイズ、貨物負荷など)は、それぞれレーザー回折と蛍光顕微鏡検査によって確認されます。マウスリンパ節は、標的注射部位の可視化及びリンパ節におけるポリマー粒子の後の沈着を可能にする無毒なトレーサー色素の末梢注入によって同定される。この技術は、リンパ節に送達される生体材料およびワクチン成分の用量および組み合わせを直接制御することを可能にし、新しい生体材料ベースのワクチンの開発に利用することができる。
リンパ節(LN)は免疫系の指令センターである。この免疫学的部位において、抗原提示細胞は、特異的な外来抗原に対して素朴なナイーブリンパ球をプライムし、細胞および体液性免疫応答を活性化する。したがって、LNはワクチンや免疫療法の提供の魅力的な標的となっています。残念ながら、ほとんどのワクチン戦略は、抗原およびアジュバントをリンパ組織1に非効率的で一時的に送達する結果となる。したがって、新しいワクチンの効力と効率に大きな影響を与える可能性があります。
新たな臨床試験に大きな関心を示したLNターゲティングの課題を回避するための1つの戦略は、直接、LN内(i.LN.)注射2-4である。これらの試験は、単純な外来処置としてワクチンをRNに送達するために超音波ガイダンスを採用した。従来の末梢注射経路と比較して、このアプローチは、アレルギーおよび癌を含む治療コンテキストにおける有意な用量節約および改善された有効性をもたらした 2-4.これらの 研究は、 リンパドレナージによって急速にクリアされた可溶性ワクチン(すなわち生体物質フリー)の注射を用いた。したがって、複数の注射または複数の注射のサイクル-これらの印象的な治療効果を達成するために投与された。LNの保持性の向上は、抗原および/またはアジュバントおよび免疫細胞との相互作用を高め、免疫細胞プライミングの効力をさらに向上させる可能性がある。この電位は、抗原の運動学およびアジュバント送達が生成した特異的免疫応答を決定する上で重要な役割を果たしていることを示す最近の研究によって支持される。さらに、薬物およびワクチンの用量を局所化および最小化することは、慢性炎症などの全身的な影響を減少または排除することができる。
バイオマテリアルはワクチンの効力と効率を高めるために広範囲に研究されてきた1,8,9 .生体材料キャリアにカプセル化または吸着することで、貨物を劣化から物理的に保護し、溶解性の制限を克服することができます。ポリマーマイクロまたはナノ粒子などの生体材料キャリアのもう一つの顕著な特徴は、いくつかのクラスの貨物を共存させ、その後、制御された間隔でこれらの貨物を放出する能力である。しかし、 生体内で生体物質ワクチンや免疫療法を妨げ続けている重要な制限は、免疫細胞の非効率的な標的化とリンパ節への限られた人身売買である。例えば、従来の経路を介した生体材料ワクチンの末梢注射(例えば皮内、筋肉内)は、典型的には、不十分なLN標的化を示し、注射部位に残存する注入物質の最大99%を4,10に残す。さらに最近では、生体物質ワクチン担体の大きさは、これらのワクチンの間質流8,10を介してLNへの優遇的人身売買または排水を改善するように調整されている。これらの進歩は、細胞および体液性免疫応答の強化につながり、新しいワクチンのLN環境を標的化し、エンジニアリングすることの重要性を強調している。
本論文は、脂質安定化ポリマー粒子とi.LN.送達を組み合わせて制御放出ワクチンデポ5,11を生成するワクチン接種プロトコルを提示する。i.LNのための外科技術を採用した最近の研究に基づいて構築する.マウス6,7,12,13では、小動物に生体物質ワクチンを注射するための迅速で非外科的な戦略を開発した5。i.LN.送達と生体物質ワクチン担体を組み合わせることで、制御放出ワクチンデポ5の単回注射後7日以内にCD8 T細胞応答が強力に強化された。強い体液性応答(すなわち抗体力剤)も生成された。両方の機能強化は、生体物質担体からの制御放出によって媒介されたリンパ節におけるワクチン成分の保持性の増加に関連していた。興味深いことに、ワクチン粒子の大きさは、これらの物質の運命を一度LNsに変えた:ナノスケール粒子は細胞による直接取り込みの高まりを示し、一方で、より大きな微粒子は細胞外LN環境に残り、LN常駐抗原提示細胞5によって取り込まれた貨物(例えばアジュバント)を放出した。これらのデータは、i.LNに注入された生体材料の大きさを制御することによって、新しいワクチンに利用される可能性のある2つの経路を示唆している。
本稿では生分解性脂質安定化ポリマー粒子(マイクロ及びナノスケール)は、改変二重エマルジョン戦略5,11を用いて合成される。粒子特性は、レーザー回折と顕微鏡検査によって特徴付けられます。これらの粒子は、次いで、一般的な、無毒なトレーサー色素14を用いて非外科的に同定されたインギナルのLNに直接注入される。細胞の細胞の取り込みと滞留を監視するだけでなく、細胞の取り込みや滞留を監視するために、細胞学またはフローサイトメトリーによるLNの射出後分析を使用して、LN環境内の粒子の分布を確認することができます。組織学的処理とフローサイトメトリーを詳述するプロトコルについては、読者は最近のJoVE記事とジャーナルレポート15-22に言及されています。典型的な結果は、強力で効率的な免疫応答を達成したり、標的病原体の免疫を調整するために利用することができるこれらの拠点の局所LNターゲティングを示している。
このプロトコルに記載されている技術は、LNおよびLN居住抗原提示細胞へのワクチンの制御された送達を可能にする。生体材料カプセル化貨物はLN内に局在化することができ、LN微小環境に送達される1種類以上の貨物の線量の操作を可能にする。ポリマー粒子からの局在化および制御放出は、従来のアプローチよりも有意に低用量で強力な細胞および体液性免疫応答を生成することが示されている。また、生体物質キャリアサイズの操作を通じて、細胞処理の一次モードは、より大きな微粒子5からのナノ粒子または細胞外貨物放出の直接取り込み間で変調することができる。これらの結果は、治療ワクチンデリバリーのためのプラットフォームとしての i.LN. 生体材料送達の実現可能性を確立する。
エマルジョン/溶媒蒸発によるPLGA粒子の合成は、薬物送達用途23,24において広く採用されている。したがって、この技術に関連する潜在的な課題は、主にLN標的部位におけるワクチンの同定および堆積の成功に関連する。トレーサー色素の使用は、ターゲットのインジナルLNの可視化を容易にするが、皮膚の下のターゲットサイズと深さは小さい。したがって、著者らは、マウスの調製および注射を練習するための時間とマウスをアロットニングすることを推奨する。動物の調製(すなわち、脱毛剤のシェービングおよび適用)中に、腹部を持つ脚の角度が皮膚をバリカンから傷害しやすくする動物の腹側のマウスを切らないように注意する必要があります。さらに、すべての脱毛剤は、動物が通常のグルーミング動作中にクリームを摂取するのを防ぐために、ぬるま湯で除去する必要があります。LN注射を実践するために、より高いトレーサー色素濃度を投与し、動物を安楽死させ、その後複数回注入することができる。次の注射マウスは、壊死させることができ、注射された動物からのLNのサイズは、未注入制御LNと比較することができる。この技法の制限の 1 つは、LN 構造にロードできる注入ボリュームの物理的限界です。我々のプロトコルは、マウスの10μlの注射量を示唆しているが、他の研究は、少なくとも20μl.13の大きな注射量を報告しているが、i.LNを介したワクチンの直接送達は劇的な用量節約を可能にするので、これらのワクチンの機能は一般的に体積制約によって制限されるべきではない。
前述のように、粒子の物理的性質(すなわちサイズ)を変えることは、LN組織における生体材料および封入された貨物によって誘発される経路または結果を変える有効なメカニズムである。エマルジョン/溶媒蒸発プロトコルは、表面電荷や機能性などの物理的または化学的特性、および生分解/貨物放出速度23,24を容易に変更することができます。例えば、放出動態は、代替ポリマー組成物を介して調整することができ、表面機能は、修飾された脂質組成物またはポリ(ビニルアルコール)を使用して変更することができる。粒子に積まれた貨物は標的病原体のための異なった抗原かアジュバントを含むために容易に操作することができる。このアプローチの利点は、i.LN. の配達とバイオマテリアルからの貨物のローカルで制御された放出の組み合わせによって達成されます。この相乗効果は、微量を使用して、非特異的/全身的な副作用を減らして、効果的に適応免疫応答を生成するために利用できるプラットフォームを確立します。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、PhRMA財団とメリーランド大学カレッジパークの研究学者賞によって部分的に資金提供されました。ダレル・アーバイン教授は、「アジュバント放出ポリマー粒子の非共性注入によるリンパ節微小環境の場でのエンジニアリング」 の完了に関する最初の作業の支援に感謝します。5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
Isoflurane | Vetone | 502017 | |
Nair | Nair | ||
Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |