定量的な光学顕微鏡：細胞生物物理の測定は、標準的な光学顕微鏡で特徴
Summary
We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.
Abstract
我々は、明視野および微分干渉コントラスト画像の組み合わせを介して質量、体積、および細胞標本上の濃度の定量的測定を行うための標準的な光学顕微鏡の使用を記載している。全細胞集団および細胞内濃度分布の測定を行うために、noninterferometric定量的位相顕微鏡（NIQPM）及びヒルベルト体積を決定するために、微分干渉コントラスト顕微鏡（HTDIC）を形質転換：つの主要なアプローチが提示される。低開口数（NA）は、照明、弱い散乱、試料による光の弱い吸収：NIQPMが波の伝播を単純化したモデルに基づいており、3基礎的前提で、近軸近似と呼ばれる。幸いなことに、無染色細胞の標本は、これらの仮定を満たし、低NAの照明は簡単、市販の顕微鏡で達成される。 HTDICは、高NAのillumin下のスルーフォーカスDICの画像からの体積情報を取得するために使用されているATION条件。高NA照明は光軸に沿った試験片の強化された切片を可能にします。ヒルベルトDIC画像に対して変換処理を大幅にスタックすることは、背景とは、試料の強度のグレー値を分離することにより、三次元での検体の境界線の局在化のためのエッジ検出アルゴリズムを強化する。 NIQPMとHTDICの主な利点は、「既製」顕微鏡を使用して自分の技術、アクセシビリティに横たわっていた。商業スコープの遅いzスタックの取得時間は、現在より速く1フレーム/分以上の現象の調査を抑止する、第二に、回折効果を10まで0.2からオブジェクトへNIQPMとHTDICの有用性を制限します。これらのメソッドの二つの基本的な制限がありますそれぞれ直径（NIQPM）と20（HTDIC）程度、。したがって、関心のある試料とそれに関連する時間ダイナミクスは、これらのメソッドの使用を可能にするために一定の大きさと時間的な制約を満たす必要があります。おもしろいこと、ほとんどの固定蜂巣r個の試験片を容易に、これらの方法で調査している。
Introduction
光学顕微鏡を使用することになりました細胞生物の調査に遍在です。 、可視光スペクトルにわたって、その低い内因性の吸光度と弱い散乱特性のために、細胞が強く、それらを横断する光波の振幅に影響を与えるため、標準的な明視野顕微鏡で画像化したときに半透明表示されません。細胞の標本は、しかしながら、直線状の光が通過する空間の特定の領域における局所質量密度の量に関連する様式でそれらを通過する光波が遅くない。この不均一タイムラグまたは顕微鏡標本を透過した光の波の「位相」プロファイルの利用は最初のフリッツゼルニケ1によって1935年に記載され、実験的にZernikein 1942 2を実現した。ゼルニケは、この達成のために1953年にノーベル賞を受賞しました。ツァイスは1945年3この様式を商品化しました。 1955年に、スミスとNomarsk私は、微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡、コントラスト機構としての位相の空間勾配を使用していますモダリティの使用4と理論5上での初期の作品を提供してしまい。 DICは、ノマル6と1965in緊密に連携ツァイスによって商品化されました。 1981年に、2研究所は、DIC顕微鏡7、8の光学列にビデオカメラを組み込むことで最初に記録された生きた細胞のDIC画像を示した。生細胞イメージングの時代が誕生しました。
この時以来、商業顕微鏡に位相差およびDICの両方の実行はほぼ横ばいとなっている。形態学のモニタリング、細胞内構造の追跡、および膜9のダイナミクスの研究：これらの方法は、主に定性的な目的のために、細胞の画像を生成する生物によって利用される。これらの技術は、位相とDIの両方としての「既製の」構成で定性的でC画像は、任意の光源強度の関数、照明光学系の設定、およびCCDカメラゲイン、ガンマ、および露光設定である。
物理学者や光学技術者の小さな軍団は、市販の画像診断法は、定量するために努めてきました。最初の努力の中で自然に2文字は、医師出身の生物物理学者ロバートBarer、市販の位相差顕微鏡を用いてこれらの細胞型を介して位相シフトを推定することによって細胞の細胞乾燥質量を測定するために位相差顕微鏡の使用を実証した1952年、1953年であった10、11。位相差顕微鏡10,11、微分干渉顕微鏡12から17と、光路長、相、質量を決定するために、明視野18〜22歳 ：フィールドは、3つの基本的なラベルフリーコントラストメカニズムをベースにその後の年間の技術を多数開発してきました密度、屈折率、および細胞容積。
パラ中llel、カスタム光学機器の大規模なコレクションには、1950年代から開発されており、寄生虫の成長23でのアプリケーションから、赤血球25の膜動態を調査し、細胞周期24を文書に至るまで光学測定を遠大てきた。具体的には、過去10年間では、回折位相差顕微鏡26の形で断層位相差顕微鏡27、デジタルホログラフィック顕微鏡28、位相敏感光コヒーレンス顕微鏡29、空間光干渉顕微鏡30、ヒルベルトのラベルフリー定量的顕微鏡の富を見ている位相差顕微鏡31、および定量的な位相差顕微鏡32。彼らの集団的成功にもかかわらず、これらの商品は、その複雑な計測および計算要件に、大部分は、生物学による研究者の大きな分野に普及していない。
本明細書で我々は、dは明視野及びDICの画像を組み合わせて質量、体積、および細胞標本上の濃度の定量的測定を行うための標準的な光学顕微鏡の使用を傍接させる。体積を決定するために、全細胞質量及び細胞内濃度分布の測定を行うために、noninterferometric定量的位相顕微鏡（NIQPM）及びヒルベルト微分干渉コントラスト顕微鏡（HTDIC）を形質転換：つの主要なアプローチが提示される。 NIQPMとHTDICの主な利点は、その技術、アクセシビリティに横たわっていた。彼らの正常な実行に必要な撮影条件は、ほとんどの市販の顕微鏡の通常の操作の範囲内である。さらに、後処理アルゴリズムは、安定した迅速、かつ堅牢である – 可能な限り高速フーリエ変換（FFT）に基づくアルゴリズムを用いて変換MATLABにおいて実施された。
NIQPMは位相およびCELの軸方向に一体化質量密度を再構築する方法であり、明視野画像からlular標本。試験片の面積に対するこの軸方向に一体化質量密度の総和は、試料の全乾燥質量含有率を提供します。それは、細胞の位相プロファイルは、サンプルのスルーフォーカス明視野画像から再構成することができることが実証された- – NIQPMプロトコルはPaganinおよびニュージェント18,19によって敷設基礎実験に基づいており、フランクの理論的研究、Altmeyer、およびウェルニッケ20 -効率的なFFTベースの方法で、近軸波モデルの解決に。乾燥質量密度相の接続はBarer 10、11とポペスク33により作業に基づいています。
ボリュメトリック情報は、光軸に沿って試料の光学切片を有効に高NAの照明条件の下でスルーフォーカスDICの画像から得ることができる。ヒルベルトDIC画像スタックに変換処理を大幅に強化バックグラウンドとは、試料の強度のグレー値を分離することにより三次元の検体の境界線の局在化のためのエッジ検出アルゴリズム。我々は、コントラストとサンプルの自動化された容積測定分析のためのソーベルベースのエッジ検出方法を強化するために、両方のフーリエフィルタリング方法を導入しているが、この作品は、Arinson ら 34で発信する。また、回折限界から最大直径36〜20μmの大きさの範囲のポリスチレン球で以前HTDICを検証しています。
NIQPMとHTDIC両方が商業顕微鏡上での開発のために技術的にアクセス可能である一方で、これらの方法は、基本的に顕微鏡自身のハードウェア構成によって制限されます。これらの技術の主な制限は2倍以下のとおりです。商業スコープの遅いzスタックの取得時間による全体試料ステージの翻訳にだけ、対物レンズとは対照的に、現在、より速くおよそ1フレーム/分以上の現象の調査を制限し、第二に、回折効果はそれぞれ、直径10〜20μmの最大0.2のサイズの範囲のオブジェクトにNIQPMとHTDICの有用性を制限する。したがって、関心のある試料とそれに関連する時間のダイナミクスは、典型的な「既製の」楽器でこれらのメソッドを使用できるようにするために一定の大きさと時間的な制約を満たす必要があります。おもしろいこと、ほとんどの固定、携帯の標本は容易にこれらの方法を用いて調査されています。
NIQPMとHTDICプロトコルの概要を図1に示す。 図2に、我々は、明視野およびDICの画像の両方のための低と高の両方のNA照明条件の下で最適と部分最適スルーフォーカスイメージングを示しています。3と4は、成功と失敗の実装を強調しNIQPMアルゴリズムのパラメータ依存性を実証する図 。 <strong>図5はHTDIC画像処理アルゴリズムに含まれるステップを示しており、細胞の体積を決定するためのアルゴリズムの最適な実装を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
一般的に、NIQPMは0.25から44.7までの光路長で検証回折限界的な技術である。検証は、Fluoromount G（データは示さず）に懸濁0.11-9.8ミクロンより= nの上に、直径1.596の範囲のポリスチレン球を行った。細胞はほぼ0〜7までの範囲の光路長を有している。
試料の濃度分布を測定する場合、1は密度マップは、不要なバックグラウンドの寄与を保有しながら、擬似DIC画像が正常に見?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立衛生研究所（OJTMへKGP、OJTMとR01HL101972にU54CA143906）とオレゴン医学研究財団初期の臨床研究者賞（KGP）からの補助金によって支えられている。 OJTMは米国心臓協会設立調査官（13EIA12630000）です。我々は、この研究で使用した細胞サンプルを調製するための騎士がん研究所の博士エリック·アンダーソンに感謝します。
Materials
| Zeiss Axio Imager 2 microscope | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | Axio Imager D2 | Microscope |
| Green filter (λ = 540 ± 25 nm) | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont | D540/25x | Green filter |
| SlideBook 5.5 software | Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado | Image acquistion software | |
| Polystyrene microspheres | Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN | PS06N | Polystyrene spheres |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama | 0100-01 | Mounting media |
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