Kvantitativ Optisk mikroskopi: Måling av Cellular Biofysisk Funksjoner med en standard optisk mikroskop

Summary

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Abstract

Vi beskriver bruken av et vanlig optisk mikroskop for å utføre kvantitative målinger av masse, volum og tetthet på celleprøver ved en kombinasjon av lys-feltet og differensialinterferenskontrastbilder. To primære tilnærminger presenteres: noninterferometric kvantitativ fase mikroskopi (NIQPM), til å utføre målinger av total cellemasse og subcellulære tetthet distribusjon, og Hilbert transformere differensial kontrast forstyrrelser mikroskopi (HTDIC) for å bestemme volum. NIQPM er basert på en forenklet modell av bølgeforplantning, betegnes den paraksiale approksimasjon, med tre underliggende antagelser: lav numerisk apertur (NA) belysning, svak spredning og svak absorpsjon av lys av prøven. Heldigvis, ufargede cellulære prøver tilfredsstille disse forutsetningene og lav NA belysning er lett oppnås på kommersielle mikroskoper. HTDIC brukes til å innhente volumetrisk informasjon fra gjennom-fokus DIC bilder under høyt NA illuminasjon forhold. Høy NA belysning muliggjør forbedret seksjonering av prøven langs den optiske aksen. Hilbert transform prosessering på DIC bildestakker forbedrer kantdeteksjonsalgoritmer for lokalisering av prøven grenser i tre dimensjoner ved å separere de grå verdier av prøveintensitet fra de av bakgrunnen. De viktigste fordelene med NIQPM og HTDIC lå i sin teknologiske tilgjengelighet ved hjelp av "off-the-sokkel" mikroskoper. Det er to grunnleggende begrensninger av disse metodene: slow z-stack oppkjøpet tid på kommersielle scopes opphever i dag etterforskningen av fenomener raskere enn en ramme / minutt, og for det andre, difraksjonsvirkninger begrenser nytten av NIQPM og HTDIC til objekter fra 0,2 opp til 10 (NIQPM) og 20 (HTDIC) pm i diameter, henholdsvis. Derfor må prøven og dens tilhørende tidsdynamikken av interesse møtes viss størrelse og tidsmessige begrensninger for å muliggjøre bruk av disse metodene. Spennende, mest fast Cellular prøvene er lett undersøkt med disse metodene.

Introduction

Bruken av optisk mikroskopi er nå utbredt i undersøkelsen av cellulære organismer. På grunn av deres lave endogene absorbans og svak spredning egenskaper over synlige optiske spekteret, ikke celler sterkt påvirke amplitude av optiske bølger som krysser dem og dermed vises bitar når avbildes med standard lyse feltmikroskop. Cellular prøver gjør imidlertid avta optiske bølger som beveger seg gjennom dem på en måte som er lineært relatert til mengden av lokale massetettheten i en bestemt region av rommet gjennom hvilke lyset. Utnyttelse av denne heterogene tidsetterslep eller "fase" profil av optiske bølger overført gjennom mikroskopiske prøver ble først beskrevet i 1935 av Frits Zernike ^pt og eksperimentelt realisert av Zernikein 1942 ^2. Zernike ble tildelt Nobelprisen i 1953 for denne prestasjonen. Zeiss kommersialisert dette modalitet i 1945 ^3. I 1955, Smith og NomarskJeg vil presentere sitt første arbeid på bruk ⁴ og teori ⁵ av differensial interferens kontrast (DIC) mikroskopi, en modalitet som bruker den romlige gradient av fase som en kontrast mekanisme. DIC ble kommersialisert av Zeiss i 1965in nært samarbeid med Nomarski ^seks. I 1981, to laboratorier demonstrert den første innspilte levende celle DIC bilder med inkorporering av videokameraer inn i optikk toget av DIC mikroskop ^{7, 8.} Epoken med levende celle bildebehandling ble født.

Siden denne tid har gjennomføring av både fasekontrast og DIC på kommersielle mikroskoper stort sett vært uendret. Disse metodene er i hovedsak brukt av biologer for å produsere bilder av celler for kvalitative formål: overvåking av morfologi, sporing av subcellulære strukturer, og undersøkelser av dynamikk membran ^ni. Disse teknikkene er kvalitative i deres "off-the-sokkel" konfigurasjon som både fase og DIC bilder er vilkårlige funksjoner lyskildens intensitet, belysnings optikk innstillinger, og CCD-kamera gevinst, gamma, og eksponeringsinnstillinger.

En liten hærskare av fysikere og optiske ingeniører har bestrebet seg på å lage kommersielle bildediagnostikk kvantitativ. Blant de første innsats var to brev til Nature i 1952 og 1953 der legen-turned-biofysiker Robert Barer demonstrert bruk av fasemikroskopi for å bestemme celle tørr masse av celler ved å estimere faseforskyvningene gjennom disse celletypene ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig fase mikroskop ^{10, 11.} Feltet har utviklet en rekke teknikker i løpet av de påfølgende årene basert rundt tre grunnleggende mekanismene label-free Kontrast: fase mikros ^10,11, DIC mikros ^12-17, og lyse felt ^18-22 for å avgjøre optisk bane-lengde, fase, masse tetthet, brytningsindeks, og cellulær volum.

I parallel, en stor samling av tilpassede optiske instrumenter har også blitt utviklet siden 1950-tallet, og har gjort vidtrekkende optiske målinger som strekker seg fra applikasjoner i parasitt vekst ^23, for å dokumentere cellesyklus ²⁴ til å undersøke dynamikken i røde blodceller ²⁵ membran. Spesielt har de siste ti årene sett et vell av label-fri kvantitativ mikroskopi i form av diffraksjon fase mikros ^26, tomographic fase mikros ^27, digital holografisk mikros ^28, fase sensitive optisk koherens mikros ^29, romlig lys forstyrrelser mikros ^30, Hilbert fasemikroskopi ³¹ og kvantitativ fasemikros ^32.. Til tross for deres kollektive suksesser, har disse instrumentene ikke blitt formidlet til større felt av biologiske forskere grunn, for det meste, til deres komplekse instrumentering og beregningsorientert krav.

Heri vi describe bruk av et vanlig optisk mikroskop for å utføre kvantitative målinger av masse, volum og tetthet på celleprøver ved en kombinasjon av lys-feltet og DIC bilder. To hovedtilnærmingsmåter er presentert: noninterferometric kvantitativ fasemikroskopi (NIQPM), for å utføre målinger av total cellemasse, og subcellulære tetthetsfordeling, og Hilbert omdanne differensialinterferenskontrastmikroskopi (HTDIC), for å bestemme volumet. De viktigste fordelene med NIQPM og HTDIC lå i deres teknologiske tilgjengelighet. Det tenkelig betingelser som kreves for deres vellykkede utførelse er innen rammen av normal drift av de fleste kommersielt tilgjengelige mikroskoper. I tillegg er post-prosesseringsalgoritmer er stabil, rask og robust – ha blitt implementert i MATLAB ved hjelp av rask Fourier transform (FFT) baserte algoritmer når det er mulig.

NIQPM er en fremgangsmåte for å rekonstruere fase og den aksialt integrert massetetthet på cellular prøver fra lyse felt bilder. Summering av denne aksialt integrert massetetthet over området av prøven gir den totale tørrmasseinnhold av prøven. Den NIQPM protokollen er basert på de eksperimentelle grunnlaget lagt av Paganin og Nugent ^{18, 19} – der det ble demonstrert at fase profilen til en celle kunne rekonstrueres fra gjennom-fokus lyse felt bilder av prøven – og det teoretiske arbeidet til Frank , Altmeyer, og Wernicke ²⁰ – om å løse de paraksiale bølgemodeller på en effektiv FFT-basert måte. Forbindelsen av fasen til den tørre masse tetthet er basert på arbeid av Barer ^{10, 11} og ^33. Popescu.

Volumetrisk informasjon kan fås fra gjennom-fokus DIC bilder under høye NA belysningsforhold som gjør det mulig optisk seksjonering av prøven langs den optiske aksen. Hilbert transform prosessering på DIC bildestakker sterkt forbedrerkantdeteksjonsalgoritmer for lokalisering av prøven grenser i tre dimensjoner ved å separere de grå verdier av prøveintensitet fra de av bakgrunnen. Dette arbeidet stammer med Arinson et al. ^34. Selv om vi har innført begge Fourier filtreringsmetoder for å forbedre kontrasten og en Sobel-basert kantdeteksjonsmetode for automatisert volumetrisk analyse av prøven. Vi har også validert HTDIC tidligere på polystyren kuler som varierer i størrelse fra diffraksjon grensen opp til 20 mikrometer i diameter ^36.

Mens både NIQPM og HTDIC er teknologisk tilgjengelige på grunn av deres utvikling på kommersielle mikroskop, er metodene fundamentalt begrenset av konfigurasjonen av mikroskop selv maskinvare. Den primære begrensninger av disse teknikkene er todelt: slow z-stack oppkjøpet tid på kommersielle scopes, på grunn av oversettelse av hele prøven scenen i motsetning til bare objektiv, Begrenser tiden etterforskningen av fenomener raskere enn omtrent en ramme / minutt, og for det andre, difraksjonsvirkninger begrense nytten av NIQPM og HTDIC til objekter som varierer i størrelse fra 0,2 opp til 10 og 20 mikrometer i diameter, henholdsvis. Derfor må prøven og dets tilhørende tids dynamikk av interesse møte viss størrelse og tidsmessige begrensninger for å muliggjøre bruk av disse metodene på typiske instrumenter "off-the-sokkel". Spennende, er de fleste faste cellulære prøver lett undersøkt med disse metodene.

En oversikt over NIQPM og HTDIC protokoller er gitt i figur 1. I figur 2 illustrerer vi optimal og suboptimal gjennom fokus bildebehandling under både lave og høye NA belysningsforhold for både lyse felt og DIC bilder. Figurene 3 og 4 viser parameter avhengighet av NIQPM algoritme fremhever vellykkede og mislykkede implementeringer. <strong> Fig. 5 illustrerer trinnene involvert i HTDIC bildebehandlingsalgoritme og viser optimal gjennomføring av den algoritme for å bestemme cellevolum.

Protocol

En. Mikroskop Spesifikasjoner For å utføre bildebehandling i riktig mote mikroskopet bør ha følgende spesifikasjoner: Besitter både differensial interferens kontrast (DIC) og lysfelt (BF) kontrast. Har datastyrt z-aksen bevegelse. Har du en justerbar blender stopper å variere kondensatoren objektivet numerisk apertur. En åpning med en gradert regel eller elektronisk avlesning er nødvendig for å vite verdien av den numeriske apertur. Den numeriske apert…

Representative Results

Riktig prøve belysning under gjennom-fokus image oppkjøpet er avgjørende for en vellykket gjennomføring av den NIQPM en nd HTDIC algoritmer. På figur 2 illustrerer vi lav og høy NA belysning under både DIC og lyse felt kontrast for en polystyren sfære og human kolorektal adenokarsinom-cellelinje SW620. Figurene 2A, 2C, 2I, og 2K viser optimal avbildning for NIQPM. Figurene 2F, 2H, 2N, og 2P demonstrere optimal b…

Discussion

Generelt er NIQPM en diffraksjon begrenset teknikk validert på optiske banelengder som spenner 0,25 til 44,7. Validering ble utført på n = 1,596 polystyrenkuler som varierer i diameter 0,11 til 9,8 mikrometer suspendert i Fluoromount G (data ikke vist). Celler har optiske banelengder som spenner fra nesten 0-7.

Ved måling av tetthet distribusjon av et eksemplar man kan finne at den pseudo DIC bildet ser fint mens kartet tettheten besitter uønsket bakgrunns bidrag. Dette er på grunn av …

Materials

Zeiss Axio Imager 2 microscope	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	Axio Imager D2	Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Green filter
SlideBook 5.5 software	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Image acquistion software
Polystyrene microspheres	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	Polystyrene spheres
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Mounting media