Количественный оптическая микроскопия: Измерение Cellular биофизических Особенности с использованием стандартного оптического микроскопа
Summary
We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.
Abstract
Мы описали использование стандартного оптического микроскопа для выполнения количественных измерений массы, объема и плотности на клеточных образцах путем сочетания светлого поля и дифференциальной интерференционной контрастной образов. Два основных подхода представлены: noninterferometric количественный фазовая микроскопия (NIQPM), для выполнения измерений общей массы клеток и внутриклеточной распределения плотности и преобразование Гильберта дифференциальное вмешательство контрастной микроскопии (HTDIC), чтобы определить объем. NIQPM основана на упрощенной модели распространения волн, называется параксиальном приближении, с тремя основных предположений: низкий числовая апертура (NA) освещения, слабым рассеянием и слабого поглощения света на образце. К счастью, неокрашенные сотовые образцы удовлетворяют эти предположения и низкой освещенности Н.А. легко достигается на коммерческих микроскопов. HTDIC используется для получения информации от объемной через фокус DIC изображений под высоким NA ILLUMINусловия Ation. Высокое освещение NA обеспечивает улучшенную секционирования образца вдоль оптической оси. Преобразование Гильберта обработку изображения DIC стеки значительно повышает алгоритмы обнаружения края для локализации образца границ в трех измерениях, разделяя серые значения интенсивности образца от тех фона. Основными преимуществами NIQPM и HTDIC лежал в своей технологической доступности, используя "вне-полке" микроскопы. Есть два основных ограничения этих методов: медленный Z-Stack время сбора на коммерческих областей в настоящее время отменяет расследование явлений быстрее, чем 1 кадра / мин, а во-вторых, дифракционные эффекты ограничивают полезность NIQPM и HTDIC к объектам от 0,2 до 10 (NIQPM) и 20 (HTDIC) мкм в диаметре, соответственно. Таким образом, образцы и связанный с ним время динамика интереса должны соответствовать определенный размер и временные ограничения для того, чтобы использование этих методов. Возбуждающе, наиболее фиксированной CELLULAг образцы легко исследованы с помощью этих методов.
Introduction
Использование оптической микроскопии является в настоящее время повсеместно в расследовании клеточных организмов. В связи с их низкой эндогенных поглощения и слабые рассеяния свойств более видимой оптического спектра, клетки не сильно влияют на амплитуду оптических волн, проходящих их и таким образом появляются полупрозрачные, когда изображается со стандартными микроскопов светлое поле. Сотовые образцы, тем не менее, замедлить оптических волн, распространяющихся через них таким образом, чтобы линейно связано с количеством местного плотности массы в конкретной области пространства, через которые свет путешествует. Использование этой гетерогенной временным лагом или "фазы" профиль оптических волн, прошедших через микроскопические образцов был впервые описан в 1935 году Фриц Цернике 1 и экспериментально реализован Zernikein 1942 2. Зернике была присуждена Нобелевская премия в 1953 за это достижение. Zeiss коммерческую этот механизм в 1945 году 3. В 1955 году Смит и Nomarskя бы представить свои первоначальные работы по применению 4 и теории 5 дифференциальной интерференционной отличие (ДВС-синдром) микроскопии, модальности, которая использует пространственный градиент фазы в качестве механизма контрастности. DIC был коммерческому Zeiss в 1965in тесном сотрудничестве с Nomarski 6. В 1981 году две лаборатории продемонстрировали первый записанный живой клетке DIC изображения с включением видеокамер в оптике поезде от ДВС микроскопом 7, 8. Родился Эпоха изображений живых клеток.
С этого времени, выполнение как фазового контраста и ДИК на коммерческих микроскопов во многом была неизменной. Эти методы в основном используются биологами для получения изображений клеток для качественных целей: мониторинг морфологии, отслеживания субклеточных структур и исследований динамики мембранных 9. Эти методы являются качественными в их "не совсем готовом виде" конфигурации, как по фазе и DIC изображения произвольные функции интенсивности источника света, настройки оптика освещение, и усиления ПЗС-камера, гамма, и настройки экспозиции.
Небольшой легион физиков и оптических инженеров стремится делать коммерческие диагностические методы количественной. Среди первых попыток были два письма природе в 1952 и 1953 годах, в которых врач, а ныне биофизик Роберт Барьер продемонстрировали использование фазовой микроскопии для определения клеточного сухой массы клеток путем оценки фазовых сдвигов через эти типы клеток с использованием коммерчески доступного фазовом микроскопе 10, 11. Поле разработала множество методов более последующие годы на основе вокруг трех основных этикеток без контрастных механизмов: фазовая микроскопия 10,11, ДВС микроскопии 12-17, и яркий полевых 18-22 определить оптическую путь длины, фазу массы плотность, показатель преломления, и клеточная объем.
В пунктеllel, большая коллекция пользовательских оптических приборов были разработаны с 1950 года, и сделали далеко идущие оптических измерений, начиная от применения в рост паразита 23, к документированию клеточный цикл 24 к исследованию мембранных динамику эритроцитов 25. В частности, за последние десять лет не видел богатство без наклеек количественного микроскопии в виде дифракционной фазовой микроскопии 26 томографического фазовой микроскопии 27, цифровой голографической микроскопии 28, фазовый чувствительной оптической когерентной микроскопии 29, пространственной интерференции света микроскопии 30 Гильберта фазовая микроскопия 31, и количественный фазовая микроскопия 32. Несмотря на их коллективных успехов, эти инструменты не были распространены в большей области биологических исследователей благодаря, в основном, для их комплексного приборов и вычислительных требований.
Здесь мы гописывать круг использование стандартного оптического микроскопа для выполнения количественных измерений массы, объема и плотности на клеточных образцах путем сочетания светлого поля и ДИК образов. Два основных подхода представлены: noninterferometric количественный фазовая микроскопия (NIQPM), для выполнения измерений общей массы клеток и внутриклеточной распределения плотности и преобразование Гильберта дифференциальное вмешательство контрастной микроскопии (HTDIC), чтобы определить, громкость. Основными преимуществами NIQPM и HTDIC лежал в своей технологической доступности. Условия формирования изображения, необходимые для их успешного выполнения находятся в пределах объема нормальной эксплуатации большинстве коммерчески доступных микроскопов. Кроме того, алгоритмы постобработки стабильны, быстрый и надежный – будучи реализованы в MATLAB, используя быстрое преобразование Фурье алгоритмы (БПФ), основанные когда это возможно.
NIQPM это метод для восстановления фазы и аксиально интегрированный массовую плотность челlular образцы из образов ярко поля. Суммирование этой оси интегральной плотности массы по площади образца дает общее массовое содержание сухого образца. Протокол NIQPM основана на экспериментальных основах, заложенных Paganin и Nugent 18, 19, – в котором было показано, что фаза профиль клетки могли быть восстановлены с помощью фокусировки светлом поле изображений образца – и теоретические работы Frank , Altmeyer и Вернике 20 – на решении параксиальных волновые модели в эффективной БПФ на основе образом. Соединение по фазе на сухую плотности массы основан на работе Барьер 10, 11 и 33 Попеску.
Объемный информация может быть получена из через фокус DIC изображений в условиях высокой освещенности НС, которые позволяют оптического секционирования образца вдоль оптической оси. Преобразование Гильберта обработку изображения стеков ОПК значительно повышаеталгоритмы обнаружения края для локализации образца границ в трех измерениях путем отделения серые значения интенсивности образца от тех фона. Эта работа происходит с Arinson др. 34. Хотя мы ввели как Фурье методы фильтрации для повышения контрастности и Собел основе метод обнаружения края для автоматизированного объемного анализа образца. Мы также подтвердили HTDIC ранее на полистирольных сфер размером от дифракционного предела до 20 мкм в диаметре 36.
Хотя оба NIQPM и HTDIC технологически доступной благодаря их развития на коммерческих микроскопов, эти методы принципиально ограничена аппаратной конфигурации самих микроскопов. Основные ограничения этих методов в два раза: медленно Z-Stack время сбора на коммерческих областей, в связи с переводом всей стадии образца, в отличие от всего объектива, В настоящее время ограничивает расследование явлений быстрее, чем примерно 1 кадр / мин, а во-вторых, дифракционные эффекты ограничивают полезность NIQPM и HTDIC к объектам площадью от 0,2 до 10 и 20 мкм в диаметре, соответственно. Таким образом, образец и связанные с временной динамики интерес должен соответствовать определенный размер и временные ограничения для того, чтобы использование этих методов на типичных «вне-полке" инструментов. Возбуждающе, большинство фиксированных сотовые образцы легко исследованы с помощью этих методов.
Обзор NIQPM и HTDIC протоколов приведены на рисунке 1. На рисунке 2 мы проиллюстрируем оптимальное и неоптимальный расфокусированной изображений под высоким и низким условиях NA освещения как для светлого поля и ДИК образов. 3 и 4 демонстрируют зависимость параметра алгоритма NIQPM подсветка удачные и неудачные реализации. <strong> Рисунок 5 показаны шаги в HTDIC алгоритма обработки изображений и демонстрирует оптимальное реализацию алгоритма для определения клеточного объема.
Protocol
Representative Results
Discussion
В общем, NIQPM является методом дифракционной утверждена оптических путем длиной от 0.25-44.7. Проверка проводилась на п = 1,596 полистирольные сферы диаметром от 0.11-9.8 мкм, суспендированных в Fluoromount G (данные не показаны). Клетки обладают оптического пути длин, которые варьируются от почти 0-7.
<p …Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Национальных Институтов Здоровья (U54CA143906 в KGP, OJTM и R01HL101972 к OJTM) и Фонда Орегон медицинских исследований ранних клинических Award следователь (KGP). OJTM является признанным следователь Американская Ассоциация Сердца (13EIA12630000). Мы благодарим доктора Эрик Андерсон из Института рака Knight для подготовки образцов клеток, используемые в этой работе.
Materials
| Zeiss Axio Imager 2 microscope | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | Axio Imager D2 | Microscope |
| Green filter (λ = 540 ± 25 nm) | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont | D540/25x | Green filter |
| SlideBook 5.5 software | Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado | Image acquistion software | |
| Polystyrene microspheres | Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN | PS06N | Polystyrene spheres |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama | 0100-01 | Mounting media |
Referências
- Zernike, F. Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung. Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).
- Zernike, F. Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects. Physica. 9 (42), 974-986 (1942).
- Blow, N. Finding Phase. Nat. Cell Biol. 11, (2009).
- Smith, F. H. . Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).
- Nomarski, G. Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées. J. Phys. Radium. 16, (1955).
- Lang, W. Nomarski differential-interference contrast microscopy. Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).
- Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris. Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).
- Inoué, S. Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy. J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).
- Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. Platelet shape change and spreading. Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).
- Barer, R. Interference microscopy and mass determination. Nature. 169, 366-367 (1038).
- Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, Refractometry of living cells. Nature. 171, 720-724 (1953).
- Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy. J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).
- Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy. J. Microsc. 214, 7-12 (2004).
- Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope. J. Microsc. 188, 149-157 (1997).
- Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging. Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).
- Xu, M. Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media. Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).
- Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude. J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).
- Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. Quantitative optical phase microscopy. Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).
- Paganin, D., Nugent, K. A. Non-interferometric phase imaging with partially coherent light. Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).
- Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. o. n. -. i. n. t. e. r. f. e. r. o. m. e. t. r. i. c. non-iterative phase retrieval by Green’s functions. J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).
- Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient. Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).
- Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope. Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).
- Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. , 105-13730 (2008).
- Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).
- Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. Optical measurement of cell membrane tension. Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).
- Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics. Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).
- Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. Tomographic phase microscopy. Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy. Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).
- Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging. Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).
- Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. Spatial light interference microscopy. SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).
- Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems. Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).
- Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics. Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).
- Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).
- Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images. J. Microsc. 199, 79-84 (2001).
- Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation. Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).
