Идентификация мышиный эритробласта субпопуляции обогащенный энуклеирующий События на нескольких спектральных изображений проточной цитометрии
Summary
Настоящий протокол описывает новый метод выявления население энуклеирующий ортохроматических эритробласты по многоспектральным потока изображений цитометрии, обеспечивая визуализацию процесса энуклеации эритробластов.
Abstract
Эритропоэз у млекопитающих заключает с драматической процессе энуклеации, что приводит к ретикулоцитов образования. Механизм энуклеации до сих пор не выяснена. Общей проблемой столкнулись при изучении локализации ключевых белков и сооружений в пределах энуклеирующий эритробластов с помощью микроскопии является трудность наблюдать достаточное количество клеток, подвергающихся энуклеации. Мы разработали протокол о романе анализа с использованием многопараметрическую высокоскоростной визуализации клеток в потоке (Multi-спектральных изображений проточной цитометрии), метод, который сочетает в себе Иммунофлуоресцентной микроскопии с проточной цитометрии, с целью выявления эффективно значительное количество энуклеирующий событий, что позволяет получить измерения и выполнить статистический анализ.
Мы сначала опишем здесь два в пробирке эритропоэз культуры методами, используемые для того, чтобы синхронизировать мышиных эритробласты и увеличить вероятность захвата энуклеации в гое время оценки. Затем мы подробно описать окрашивание эритробластах после фиксации и проницаемости для изучения локализации внутриклеточных белков или липидного плоты во время энуклеации по многоспектральная потока изображений цитометрии. Наряду с размером и DNA/Ter119 окрашивания, которые используются для идентификации ортохроматических эритробласты, мы используем параметры "Соотношение сторон" ячейки в канале светлого поля, что помогает в признании удлиненных клеток и "дельта центроидного XY Ter119/Draq5 "что позволяет идентифицировать клеточных событий в которой центр Ter119 окрашивания (зарождающейся ретикулоцитов) является далеко друг от друга от центра Draq5 окрашивания (ядро претерпевает экструзии), что указывает на ячейку собирается выяснять. Подмножество ортохроматической населения эритробластов с высокой дельта тяжести и малого удлинения настоятельно обогащенный энуклеирующий клетки.
Introduction
Терминальной дифференцировки эритроидных в линии у млекопитающих заключает с резким процессе энуклеации, через который ортохроматический эритробласт вытесняет его мембрану в корпусе ядро (pyrenocyte) 1, генерируя ретикулоцитов 2. Точный механизм этого процесса, который также является ограничение скорости шаг успешным, масштабная, производство красных кровяных клеток в пробирке, еще не полностью выяснены. Локализация ключевых белков и сооружений в пределах энуклеирующий эритробластах основывается на использовании флуоресцентного и электронной микроскопии 3-5. Этот трудоемкий процесс обычно приводит к идентификации ограниченного числа энуклеации событий и не всегда позволяет значимого статистического анализа. Развивая метода идентификации эритробластов описанной ранее МакГрат и др.. 6, мы разработали новый подход к идентификации и изучения энуклеации события по многоспектральные ИмаПеренять проточной цитометрии (многопараметрических высокоскоростной визуализации клеток в потоке, метод, который сочетает в себе флуоресцентной микроскопии с проточной цитометрии) 7, которые могут обеспечить достаточное количество наблюдений, чтобы получить измерения и выполнить статистический анализ.
Здесь мы описываем первые два в пробирке эритропоэз культуры методами, используемые для синхронизации эритробласты и повысить вероятность захвата энуклеацию на момент оценки. Тогда мы подробно описать окрашивание эритробластах после фиксации и проницаемости для изучения локализации внутриклеточных белков или липидного плоты во время энуклеации по многоспектральная потока изображений цитометрии.
Образцы работать на потоке изображений цитометр и собранные клетки закрытого соответствующим определить ортохроматических эритробласты 6. Ортохроматический эритробластов затем анализируют на основе их пропорции, как измерено в светлое IMAПеренять, по сравнению с их значение для параметра дельта центроидного XY Ter119-ДНК, которая определяется как расстояние между центрами областей, окрашенных для Ter119 и ДНК соответственно. Популяция клеток с низким соотношением сторон и высокой дельта тяжести XY Ter119/DNA настоятельно обогащенный энуклеирующий клетки. Использование дикого типа (WT) эритробластов по сравнению с эритробластов Mx-Cre опосредованного условной делеции Rac1 на RAC2 – / – или комбинированной RAC2 – / -; Rac3 – / – генетический фон и этот анализ новый протокол из нескольких спектральных изображений потока цитометрии, недавно мы показали, что энуклеации напоминает асимметричную цитокинеза, и что формирование актомиозинового кольца регулируемого частично Rac GTPases важен для энуклеации прогрессии 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
В последние годы изучение эритробластов энуклеации приобрел большее импульс, так как это является шагом в в пробирке эритропоэз культур, которые наиболее трудно воспроизвести эффективно для достижения успешного, крупномасштабное производство красных кровяных клеток экс есте…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Исследования проточной цитометрии Ядро в больнице Research Foundation Цинциннати Детская и Ричард Demarco, Sherree другу, и Скотт Мордехая от Amnis Corporation (часть EMD Milllipore) для экспертной технической поддержки. Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья предоставляет K08HL088126 и R01HL116352 (TAK) и P30 DK090971 (YZ).
Materials
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25G5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
Referências
- McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
- Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
- Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
- Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
- Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
- Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
- Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
- Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
- Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
