Isolation des corticale microglie avec immunophénotype préservée et fonctionnalité De murins nouveau-nés
Summary
Une des clés de réussite de l'enquête de la biologie de la microglie est la préservation de la microglie immunofunction ex vivo lors de l'isolement de tissu du SNC. Isoler la microglie par les résultats serrant rotatifs dans des cultures de cellules de grande pureté et immunofonctionnel évaluée par imagerie de fluorescence, immunocytochimie, et ELISA activation de la microglie suivante avec le lipopolysaccharide stimuli pro-inflammatoires (LPS) et Pam 3 CSK 4 (Pam).
Abstract
Isolation de la microglie du tissu du SNC est un puissant outil d'enquête utilisé pour étudier la biologie de la microglie ex vivo. La présente méthode décrit en détail une procédure d'isolement de la microglie à partir de cortex de souris néonatales par agitation mécanique avec un agitateur rotatif. Cet isolement de la microglie méthode donne de la microglie corticales très pures qui présentent des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles indicatifs de la microglie de repos dans des conditions normales non pathologiques in vivo. Cette procédure préserve aussi l'immunophénotype de la microglie et la fonctionnalité biochimique tel que démontré par l'induction de changements morphologiques, la translocation nucléaire de la sous-unité p65 de NF-kB (p65), et la sécrétion de la cytokine marque de pro-inflammatoire, facteur de nécrose tumorale α (TNF-α ), sur le lipopolysaccharide (LPS) et Pam 3 CSK 4 (Pam) défis. Par conséquent, la procédure d'isolement présente préserve l'immunophénotype de repos et deux actimicroglie vée, en fournissant une méthode expérimentale d'enquêter sur la microglie biologie dans des conditions ex vivo.
Introduction
Cellules de la microglie, les macrophages de surveillance du parenchyme du système nerveux central, représentent environ 12% de la population cellulaire totale du cerveau des mammifères adultes. Les microglies sont issus de la vésicule ombilicale myéloïdes cellules précurseurs et de modification de la densité cellulaire et de morphologie dans différentes régions cytoarchitecturales dans le SNC adulte 1-5. Dans un cerveau adulte en bonne santé, les microglies sont petites, ramifiées ou polaires cellules avec, des processus dynamiques fines. Contrairement aux périphériques macrophages morphologie, la microglie démontrent un repos, à profil bas phénotype dans les cerveaux sains qui peuvent apparaître comme l'inactivité cellulaire, mais des études in vivo d'imagerie montrent que les processus microgliales s'étendent dynamiquement et se rétractent pour surveiller leur microenvironnement dans une manière qui rappelle " l'échantillonnage et l'arpentage "6,7.
Les microglies sont fortement et de manière différentielle en réponse à des modifications environnementales et physiopathologiques dans le cerveau, de commutationd'un surveillant à un pays considéré comme leur repos et activées couramment étatiques effectrices, respectivement. Ce commutateur dans l'activation peut être médiée par l'engagement des récepteurs membranaires reconnaissance de formes (PRR), tels que les récepteurs Toll-like (TLR), qui répondent aux motifs moléculaires associés à des pathogènes (PAMP), les lipoprotéines à savoir bactériennes et virales dérivés , des acides nucléiques, des hydrates de carbone et 8-11. En plus de PAMP, PRR ont également été montré pour induire l'activation des microglies contre, des molécules stériles non pathogènes connus comme des modèles moléculaires danger / dommages-associé (atténue), qui représentent une perturbation dans l'homéostasie du système nerveux central, tels que les dommages cellulaires 12-16. Une fois engagé, PRR initier une intracellulaire cascade qui se traduit par des changements dans la morphologie des cellules et l'expression des gènes de la microglie de signalisation, plus précisément, les microglies activées adapter un phénotype de amoeboid-like, la translocation de la p65 de NF-kB sous-unité (p65) dans le noyau de la cellule, et réguler à la hausse l' production et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, tels que facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), l'interleukine-1 β (IL-1β), et aussi d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) de 16 à 24. Bien intégré dans la réponse immunitaire innée du système nerveux central, ces molécules sécrétées ont également été trouvés à augmenter le stress oxydatif neuronale, induisant de ce fait et en exacerbant la neurodégénérescence dans les états malades telles que la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer 25-29.
Cependant, les mécanismes d'activation de la microglie dans les états pathologiques ne sont pas complètement compris. Par conséquent, l'isolement de la microglie est un puissant outil d'enquête dans ces processus biologiques, comme beaucoup de caractéristiques in vivo de l'activation de la microglie peut être récapitulé dans la culture. Plusieurs méthodes sont disponibles pour isoler les microglies, y compris l'isolement par un gradient de Percoll après digestion enzymatique de tissu du SNC 30,31. Cependant, une digestion enzymatique peut modifierl'immunophénotype des cellules en réduisant la surface cellulaire antigène expression 32, et les résultats dans le rendement de la cellule par animal inférieur que le procédé décrit ici. Plus précisément, nous présentons un rendement de microglies moyenne par chiot cortex de 7,5 x 10 5 cellules, alors que précédemment rapporté méthodes de l'ensemble du système nerveux central d'isolement par un rendement de gradient de Percoll 3-5 x 10 5 cellules 30,33,34. La présente procédure contourne l'utilisation d'enzymes de digestion en isolant la microglie en fonction de leurs propriétés de faible adhérence, préservant ainsi l'immunophénotype des microglies et la fonctionnalité.
Dans la présente étude, nous décrivons l'isolement des cellules microgliales de cultures gliales mixtes issus de hétérozygotes CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -), néonatale et C57BL / 6 cortex de souris par agitation mécanique sur un agitateur rotatif, une extension de déjà Procédé publiée 24,35. Nous utilisons la souche de souris ancien pour une visualisation facile des microglies, commeCes souris expriment la GFP sous le contrôle du locus endogène CX3CR1 – un promoteur spécifique des monocytes de 36 à 38. Cette méthode produit des cultures microgliales très pur avec un immunophénotype conservés ex vivo comme démontré par des changements morphologiques, la translocation nucléaire de p65, ainsi que la sécrétion de TNF-α en cas de contestation par le lipopolysaccharide bactérien (LPS) ou Pam 3 CSK 4, TLR4 et TLR1 / 2 agonistes , respectivement.
Protocol
Representative Results
Discussion
La présente procédure offre une méthode efficace pour l'isolement de la microglie corticaux de souris néonatales. Cette procédure a un double avantage de 1) la préservation immunophénotype microglie et la fonctionnalité, telle que déterminée par l'imagerie de fluorescence, immunocytochimie, et ELISA, et 2) permettant la microglie à échéance à la présence d'autres cellules gliales (astrocytes et oligodentrocytes) avant l'isolement, ce qui peut faciliter les interactions cellule-cellule impo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 inch; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of specific equipment | |||
| Name of Equipment | Name of Company | Catalogue Number | Comments |
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
Referências
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