Crônica de Longo Prazo<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Infecção das vias aéreas em ratos
Summary
Descreve-se o método de ágar-esferas de estabelecer infecção das vias aéreas persistente a longo prazo crônica Pseudomonas aeruginosa no modelo de mouse.
Abstract
Um modelo do rato de infecção crônica das vias aéreas é um elemento essencial na fibrose cística (FC) de pesquisa, embora haja uma série de preocupações sobre o próprio modelo. Fases precoces da infecção e inflamação tem sido amplamente estudado utilizando o modelo de rato de agar-grânulos de Pseudomonas aeruginosa, embora apenas alguns relatórios têm-se centrado na infecção crónica a longo prazo in vivo. O principal desafio para a infecção crónica a longo prazo continua a ser a baixa carga bacteriana por P. aeruginosa e o baixo percentual de semanas ratos infectados após o desafio, indicando que as células bacterianas são progressivamente apuradas pelo anfitrião.
Este artigo apresenta um método para a obtenção de infecção crônica eficiente a longo prazo em camundongos. Este método baseia-se na incorporação do p estirpes clínicas aeruginosa no agar-beads in vitro, seguida por instilação endotraqueal em ratos C57Bl/6NCrl. Infecção pulmonar bilateral está associada a SEVeral mensuráveis de leitura-outs incluindo perda de peso, mortalidade, infecção crônica, e na resposta inflamatória. O P. aeruginosa RP73 tensão clínico foi preferido em relação a cepa de laboratório de referência PAO1 uma vez que resultou em uma taxa de mortalidade mais baixa comparativamente, as lesões mais graves, e infecção crônica superior. P. colonização aeruginosa pode persistir no pulmão por mais de três meses. Patologia do pulmão murino se assemelha ao de pacientes com FC com doença pulmonar crônica avançada.
Este modelo murino imita mais de perto o curso da doença humana e pode ser utilizado tanto para os estudos sobre a patogénese e para a avaliação de novas terapias.
Introduction
A fibrose cística (FC) é uma doença genética causada por mutações no transmembrana da fibrose cística condutância gene regulador (CFTR). Este gene codifica para um canal de cloreto expressa na membrana da maior parte das células epiteliais. Destruição bronquiectasia, o entupimento do muco e do parênquima causada principalmente por infecções por Pseudomonas aeruginosa, progressivamente, induzir doença pulmonar grave e mortalidade na maioria dos pacientes com FC 1. Entendimento patogênese CF e um maior desenvolvimento de novas terapias confiar em modelo animal com traços característicos da CF. Vários ratinhos geneticamente modificados, para o gene de CFTR, foram gerados, mas limitações na capacidade destas espécies para recapitular doença pulmonar CF-like e várias outras alterações de órgãos observados em pacientes com FC foi amplamente documentado 2.
Desenvolvimento de infecção é um dos principais desafios na CF modelo animal. Os cl literaturainiciais sugerem que uma infecção crónica que durou mais do que um mês pode ser conseguido somente se os ratinhos são inoculados com bactérias incorporados num agente imobilizante tais como agar, agarose, ou algas alginato 3-5. Estes agentes imobilizantes proporcionar as condições microaeróbico / anaeróbias, que permitem que as bactérias crescem na forma de microcolónias, de forma semelhante para o crescimento no muco de doentes CF 6. Este modelo de infecção crônica leva à persistência da bactéria nos pulmões, causando inflamação das vias respiratórias e danos 7. No entanto, dependendo do método utilizado, a estirpe bacteriana e da dose inoculada nos pulmões, a percentagem de ratinhos infectados crónicas e a carga bacteriana nos pulmões recuperado em diferentes pontos de tempo pode variar consideravelmente. Em particular, o principal desafio para a infecção crônica a longo prazo continua a ser a baixa carga bacteriana por P. aeruginosa e o baixo percentual de semanas ratos infectados após o desafio, indicando that células bacterianas são progressivamente apuradas pelo anfitrião. Ao selecionar o P. aeruginosa RP73 tensão clínico de uma coleção de CF isola 8 obtivemos êxito baixa mortalidade, as lesões mais graves, e alta porcentagem de infecção crônica com uma carga bacteriana estável até um mês em ratos C57Bl/6NCrl.
Este artigo detalha a metodologia para a incorporação de P. aeruginosa nos grânulos de agar; temos de camundongos infectados por instilação intratraqueal, medido a carga bacteriana nos pulmões e citocinas, recolhidos do fluido BAL e realizado o exame histológico. No geral, este protocolo vai ajudar os pesquisadores na abordagem de questões fundamentalmente importantes na patogênese 8,9 e teste de novas terapias contra o P. aeruginosa infecção crônica 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
As etapas críticas do P. preparação aeruginosa-esferas e desafio do mouse são relatados abaixo.
A cepa P. aeruginosa utilizado para ratos desafio é crítica. A mortalidade, infecção crônica ou depuração podem diferir significativamente dependendo da cepa bacteriana utilizada para o desafio. O P. aeruginosa RP73 tensão clínico foi preferido em relação a cepa de laboratório de referência PAO1 uma vez que resultou em uma taxa de morta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pesquisa no laboratório de Bragonzi foi financiado pela Fundação de Fibrose Cística italiano (CFaCore) e UE-F7-2009-223670. Parte deste trabalho foi realizado em ALEMBIC, um laboratório de microscopia avançada, e mouse histopatologia foi realizada na Unidade de Anatomia Patológica (Instituto Científico San Raffaele).
Materials
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml syringe 25 G 5/8'' 0.5 x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22GA 0.9 x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% neutral buffered formalin | Bio-optica | 05-01005Q | |
| Harris haematoxylin non Papanicolau | Bio-optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-optica | 05-M11007 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366931(great) | |
| 2366925(small) | |||
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 |
Referências
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