Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo
Summary
Este vídeo demonstra uma estratégia fácil e confiável para a preparação de culturas puras de células endoteliais do cérebro anterior embrionário dentro de 10-12 dias e será útil para a pesquisa focada em muitos aspectos da angiogênese cerebral.
Abstract
Células endoteliais cerebrais embrionárias podem servir como uma ferramenta importante no estudo da angiogênese eo desenvolvimento neurovascular e interações. As duas redes vasculares do cérebro anterior embrionário, pial e periventricular, são espacialmente distinta e têm diferentes origens e padrões de crescimento. As células endoteliais das redes vasculares pial e periventriculares têm perfis de expressão de genes únicos e funções. Aqui apresenta-se um protocolo de passo-a-passo para o isolamento, a cultura, e a verificação de populações puras de células endoteliais a partir da rede vascular periventricular (PVECs) do prosencéfalo embrionário (telencéfalo). Nesta abordagem, telencéfalo desprovido de membrana pial obtido a partir do dia embrionário 15 ratinhos é picada, digeridos com colagenase / dispase e disperso mecanicamente numa suspensão de células individuais. PVECs são purificados a partir de suspensão de células utilizando selecção positiva com anticorpo conjugado com MicroBeads anti-CD-31/PECAM-1 usando um forte magnéticométodo de separação. Células purificadas são cultivadas em colágeno 1 revestidas placas de cultura em meio de cultura de células endoteliais, até que se tornar confluentes e mais subcultivadas. PVECs obtidos com esta exposição de paralelepípedos protocolo e fenótipos fusiformes, visualizadas por microscopia de luz de contraste de fase e microscopia de fluorescência. Pureza de culturas PVEC foi estabelecida com marcadores de células endoteliais. Em nossas mãos, este método confiável e consistente produz populações puras de PVECs. Este protocolo irá beneficiar estudos para obtenção de conhecimentos mecanicistas em prosencéfalo angiogênese, compreender as interacções PVEC e transversais conversações com os tipos de células neuronais e tem um enorme potencial para a angiogênese terapêutica.
Introduction
A angiogênese, neurogênese e migração neuronal são eventos críticos no sistema nervoso central (SNC) de desenvolvimento, reparo e regeneração. Vários estudos elegantes mostraram que células endoteliais estimular a proliferação neuronal e vice-versa através da liberação de fatores solúveis e pelo contato direto. Descobrimos que é curioso que na maioria dos estudos 1-3, enquanto progenitoras neuronais / células estaminais neurais são isoladas a partir do cérebro embrionário, que são co-cultivados com células endoteliais do cérebro adulto, outras fontes de tecido adulto, ou com linhas de células endoteliais. Isto pode em parte ser devido aos problemas técnicos associados com o isolamento e cultivo de populações puras de células endoteliais do cérebro embrionário. No entanto, a angiogénese, a neurogénese e migração neuronal são eventos que ocorrem em simultâneo, em ordens de magnitude mais robusto no cérebro embrionário do que no cérebro adulto normal. A rede vascular periventricular do embryonic prosencéfalo (telencéfalo) origina a partir de um navio localizado no primórdio gânglios basais e desenvolve-se na forma de um gradiente de ordenada ventral dorsal telencéfalo por dia embrionário 11 (E11), 4,5. Este plexo de vasos da rede vascular periventricular são distintos dos vasos pial com base em origens, localização anatômica, os padrões de crescimento e regulação do desenvolvimento 4,5. A direção de propagação do gradiente angiogênese periventricular corresponde ao gradiente neurogenético transversal telencefálico. Dentro do telencéfalo, o gradiente de angiogénese periventricular e o gradiente de neurónios GABA migram tangencialmente sobrepõe espacialmente assim 6. No que diz respeito ao tempo, a inclinação da angiogénese é, antes da inclinação e do neurónio GABA gradiente neurogenético por cerca de um dia. Assim, as células endoteliais periventriculares são espacialmente e temporalmente bem posicionada para fornecer pistas importantes para apoiar a neurogênese e telencefálico4,6 migração neuronal. Portanto, o uso de células endoteliais periventriculares embrionárias em experimentos de co-cultura com células progenitoras e / ou neurônios neuronais forneceria um modelo mais favorável para o estudo de interações neurovasculares e desenvolvimento de novos caminhos para o tratamento de doenças neurodegenerativas ou da lesão cerebral isquêmica / traumático.
Ressaltamos a importância de remover a membrana pial, não só para limitar a contaminação de células epiteliais, mas também para separar as células endoteliais pial que são molecularmente e funcionalmente distinto de células endoteliais da rede vascular periventricular 4,6 (PVECs denominado para distinguir de pial ECs) . Aqui, descrevemos o método que usam rotineiramente em nosso laboratório para obter um rendimento rico e puro de PVECs. Estas células endoteliais são preparados a partir de prosencéfalo embrionário isolado a partir de um único rato cronometrado-grávida. Eles podem ser expandidas, subcultivadas e congelado para baixo com êxito para utilização futura.
Protocol
Representative Results
Discussion
PVEC do são mais fisiologicamente relevante do que as células endoteliais adultas do cérebro e células endoteliais provenientes de outras fontes de tecidos para estudos sobre interações neurovasculares e também têm potencial terapêutico. Para a preparação PVEC, é princípio fundamental com dissecção de trabalhar rápido para conseguir uma boa viabilidade desde as células mortas pode ligar de forma inespecífica a MicroBeads CD31. Além disso, se a suspensão de uma única célula não é conseguido antes …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma Aliança Nacional para a Pesquisa sobre Esquizofrenia e Depressão (NARSAD) Young Investigator Award e National Institutes of Health conceder R01NS073635 a AV.
Materials
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| glutamax | Life Technologies | 305050-061 | |
| tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soyabean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Vectashield Hardset Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Flouroscent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz surgical instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz surgical instrument | RS5611 |
Referências
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