Выделение и культуры эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга
Summary
Это видео демонстрирует простой и надежный стратегию подготовки чистых культур эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга в течение 10-12 дней и будет полезна для исследования сосредоточены на многие аспекты мозговой ангиогенеза.
Abstract
Эмбриональные мозг эндотелиальные клетки могут служить в качестве важного инструмента в изучении ангиогенеза и развития нервно-сосудистого и взаимодействий. Два сосудистые сети эмбрионального переднего мозга, мягкой мозговой оболочки и Перивентрикулярная, пространственно отличительные и имеют различное происхождение и динамику роста. Эндотелиальных клеток из мягкой мозговой оболочки и перивентрикулярных сосудистых сетей имеют уникальные профили экспрессии генов и функции. Здесь мы представляем шаг за шагом протокол для изоляции, культуры и проверки чистых популяций эндотелиальных клеток из перивентрикулярном сосудистой сети (PVECs) эмбрионального переднего мозга (конечный мозг). При таком подходе конечный мозг лишен пиальных мембраны, полученной из эмбриональных день 15 мышей фарш, расщепляли коллагеназы / диспазы, и диспергировали механически в суспензии отдельных клеток. PVECs очищают от клеточной суспензии с использованием позитивного выделение anti-CD-31/PECAM-1 антитела, конъюгированного с микросферы с помощью сильного магнитногометод разделения. Очищенные клетки культивируют на коллаген 1 покрытых чашек для культивирования в эндотелиальной клеточной культуральной среды, пока они не сливаться и далее субкультивировали. PVECs получены с этого протокола выставочная булыжник и шпинделя форме фенотипов, как визуализируется фазового контраста световой микроскопии и флуоресцентной микроскопии. Чистоту PVEC культур был создан с маркеров эндотелиальной клетки. В наших руках, этот метод надежно и последовательно дает чистые популяции PVECs. Этот протокол принесет пользу исследований, направленных на получение механистические понимание переднего мозга ангиогенеза, понимая PVEC взаимодействия и перекрестные переговоры с нейронных типов клеток и имеет огромный потенциал для терапевтического ангиогенеза.
Introduction
Ангиогенеза, нейрогенез и миграция нейронов являются важнейшими событиями в центральной нервной системе (ЦНС) развития, восстановления и регенерации. Несколько элегантные исследования показали, что эндотелиальные клетки стимулируют пролиферацию нейронов и наоборот посредством выпуска растворимых факторов и при непосредственном контакте. Мы обнаружили, что любопытно, что в большинстве этих исследований 1-3, в то время как нейронные предшественниках / нервные стволовые клетки выделяют из эмбрионального мозга, они культивировали совместно с эндотелиальных клеток из мозга взрослого человека, других источников для взрослых тканей или с эндотелиальных клеточных линий. Это может быть частично из-за технических трудностей, связанных с ОД и культивирования чистые популяции эндотелиальных клеток из эмбриональных мозга. Однако, ангиогенез, нейрогенез и миграция нейронов являются одновременно события, происходящие в порядков более надежной в эмбриональном мозге, чем в нормальном взрослом мозге. Перивентрикулярная сосудистая сеть из embryoniс переднего мозга (конечный мозг) происходит от судна, расположенного в базальных ганглиев зачатка и развивается в виде упорядоченной градиентом от вентральной спинного конечного мозга на эмбриональный день 11 (Е11) 4,5. Это сплетение сосудов перивентрикулярном сосудистой сети отличаются от мягкой мозговой оболочки сосудов на основе происхождения, анатомического расположения, характер роста, и регулирование развития 4,5. Направление распространения перивентрикулярном ангиогенеза градиента соответствует конечного мозга поперечную нейрогенного градиент. В конечном мозге, перивентрикулярная ангиогенез градиент и градиент ГАМК нейронов мигрируют по касательной перекрывает пространственно, а 6. Что касается сроков, ангиогенез градиент в преддверии нейрогенного градиента и ГАМК нейронов градиентом примерно на сутки. Таким образом, перивентрикулярные эндотелиальные клетки в пространстве и времени и возможности для предоставления критических сигналы для поддержки конечного мозга нейрогенез имиграции нейронов 4,6. Таким образом, использование эмбриональных перивентрикулярных эндотелиальных клеток в сокультивирования экспериментов с нейронных клеток-предшественников и / или нейронов обеспечит более благоприятные модель для изучения нейроваскулярные взаимодействия и разработки новых путей для лечения нейродегенеративных заболеваний или ишемического / черепно-мозговой травмой.
Мы подчеркиваем важность устранения пиальных мембрану, не только для ограничения загрязнения эпителиальных клеток, но и отделить пиальных эндотелиальные клетки, которые на молекулярном уровне и функционально отличается от эндотелиальных клеток перивентрикулярном сосудистой сети 4,6 (называемые PVECs отличить от пиальных ECS) . Здесь мы описываем метод, который мы обычно используем в нашей лаборатории, чтобы получить богатый и чистый выход PVECs. Эти эндотелиальные клетки получают из эмбриональных переднего мозга, выделенных из одного тайм-беременной мыши. Они могут быть расширены, субкультивировали, и замораживали успешно для использования в будущем.
Protocol
Representative Results
Discussion
PVEC являются более физиологически актуальным, чем взрослых эндотелиальных клетках головного мозга и ЭК из других источников тканей для исследований, посвященных сосудисто-нервных взаимодействий, а также имеют терапевтический потенциал. Для подготовки PVEC, очень важно начало с рассече?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным альянсом по изучению шизофрении и депрессии (NARSAD) премия для молодых следователь и Национальных Институтов Здоровья предоставляют R01NS073635 к AV.
Materials
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| glutamax | Life Technologies | 305050-061 | |
| tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soyabean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Vectashield Hardset Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Flouroscent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz surgical instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz surgical instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
