Генерация сдвига адгезии карте с помощью SynVivo Синтетический микрососудистых сетей
Summary
Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.
Abstract
Адгезии анализы Сотовый / частиц имеют решающее значение для понимания биохимических взаимодействий, участвующих в патофизиологии заболеваний и имеют важные приложения в стремлении к разработке новых терапевтических средств. Анализы, использующие статические условия не в состоянии захватить зависимость адгезии на сдвиг, что ограничивает их корреляцию с окружающей среды в естественных условиях. Параллельные камеры потока пластина, которая количественно адгезию при физиологической потока жидкости нужно несколько экспериментов для генерации сдвига адгезии карте. Кроме того, они не представляют естественных условиях масштаба в и морфологию и требуют больших объемов (~ мл) реагентов для экспериментов. В этом исследовании, мы демонстрируем поколение сдвига адгезии карте из одного эксперимента с использованием сети микрососудов микрожидкостных устройств, SynVivo-SMN основе. Это устройство воссоздает комплекс в естественных условиях сосудистой включая геометрической шкале, морфологических элементов, особенности течения и клеточных взаимодействий вФормат в пробирке, тем самым обеспечивая биологически реалистичное окружение для фундаментальных и прикладных исследований в клеточной поведения, доставки лекарств и лекарственных препаратов. Анализ показал, изучая взаимодействие мкм биотина покрытием частиц 2 с авидином покрытием поверхности микрочипа. Весь ассортимент сдвига, наблюдаемого в микрососудов получается в одном анализа позволяет адгезии против карте сдвига для частиц в физиологических условиях.
Introduction
Текущие анализы для изучения в клетка-клетка и частица-клеточных взаимодействий обычно включают статический формат луночный планшет, в котором частицы или клетки инкубируют в белковых матриц или адгезивных клеток. В конце указанного времени инкубации, количество прилипших частиц или клеток количественно с помощью микроскопии 1. Даже если эти анализы обеспечивают значительно углубить понимание биохимических процессов, стоящих за этими взаимодействиями, основным ограничением является отсутствие физиологического течения жидкости (типичный микроциркуляции) и его влияние на адгезию частиц.
Чтобы преодолеть это ограничение, в пробирке проточных камерах были разработаны в последние годы. Общим элементом этих проточных камерах представляет собой прозрачную устройство перфузии при небольших числах Рейнольдса, чтобы соответствовать скорости сдвига стены, наблюдаемые в кровеносных сосудах в естественных условиях 2. Стенке сосуда моделируется либо покрытие из биомолекул или роста клеток на одной поверхности потока сHamber 3. Частицы 4-7 или 8-16 клетки затем течет в в желаемом диапазоне расходов количественно количество придерживаясь частиц при различных скоростях сдвига.
Тем не менее, использование параллельных проточных камерах пластина для изучения и проверки биохимические явления довольно дорого и отнимает много времени. Это происходит главным образом из-за того, что несколько экспериментов должны быть проведены для генерирования карту жидкостного сдвига от количества частиц / клеток прилипшего. Кроме того, камеры потока пластина требуют больших объемов реагентов из-за их большого размера (высота> 250 мкм и шириной> 1 мм). Наконец, эти устройства не точно моделировать геометрические особенности (например, бифуркации) и условий обтекания (например, сходящиеся против расходящиеся потоки), которые присутствуют в естественных условиях.
Последние достижения в области литографии на основе микротехнологий 17-19 ускорили поле лаборатории-на-чипеустройства 20-21. Эти устройства играют важную роль в развитии миниатюрные версии камеры параллельного потока пластина с размерами в режиме микрометра. Снижение размерности также дает значительные преимущества с точки зрения объемов реагентов, клетки или частицы, необходимой для экспериментов. Тем не менее, ключевым ограничение имеющихся в настоящее время устройств является использование линейных каналов для моделирования микрососудов, которые не имитируют сложную микроциркуляторного русла наблюдается в естественных условиях.
Недавно мы разработали новый методику воссоздания микрососудистых сетей на одноразовых пластиковых подложках в результате чего синтетического представления естественных условиях обстановки в. Эти устройства называются SynVivo-Синтетические Микрососудистые сети (SMN) разрабатываются с использованием PDMS основе процесса плавного литографии. Устройства SynVivo-SMN может быть использован для получения сдвига адгезии карту адгезии 22 клеток / частиц, исследование целевой доставки лекарств 23 и чAve была подтверждена против естественных условиях данных в 24-25. В этой статье мы приводим протокол, который позволяет поколение сдвига адгезии карте из одного эксперимента объемов как малые, как 1-5 мкл тем самым приводит к значительной экономии ресурсов и времени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Параллельных камер потока пластина, обеспечивая при этом значительные понимание клетка-клетка и клетка-частичных взаимодействий, имеют несколько ограничений, таких как высокое потребление реагентов и необходимости нескольких опытов, чтобы генерировать сдвига адгезии карту. Использ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Технология SynVivo был разработан в рамках гранта # 2R44HL076034 от NHLBI.
Materials
| SynVivo-SMN | CFD Research | SMN-001 | Exclusive at CFDRC |
| CFD-ACE+ | ESI Inc. | N/A | |
| Avidin | Invitrogen | 43-4401 | Any avidin source will work for this assay |
| Biotinylated Particles | Polysciences | 24173-1 | Any source of biotinylated particles will work for the assay |
| Tygon Tubing | VWR | 63018-044 | Size is typical for use with SynVivo-SMN |
| NIKON Elements | NIKON Instruments | N/A | Any other imaging software can be used |
Referências
- Weitz-Schmidt, G., Chreng, S. Cell adhesion assays. Methods Mol Biol. 757, 15-30 (2012).
- Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte recruitment under flow conditions. Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).
- Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. Jr Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment. Annu Rev Med. 47, 413-421 (1996).
- Adriani, G., et al. The preferential targeting of the diseased microvasculature by disk-like particles. Biomaterials. 33, 5504-5513 (2012).
- Decuzzi, P., et al. Flow chamber analysis of size effects in the adhesion of spherical particles. Int J Nanomedicine. 2, 689-696 (2007).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. Am J Physiol Cell Physiol. 289, 415-424 (2005).
- Sakhalkar, H. S., et al. Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15895-15900 (2003).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers – a practical guide. Platelets. 23, 229-242 (2012).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J Vis Exp. 66 (66), (2012).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel E-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7, (2012).
- Ploppa, A., Schmidt, V., Hientz, A., Reutershan, J., Haeberle, H. A., Nohé, B. Mechanisms of leukocyte distribution during sepsis: an experimental study on the interdependence of cell activation, shear stress and endothelial injury. Crit Care. 14, 201 (2010).
- Oh, H., Diamond, S. L. Ethanol enhances neutrophil membrane tether growth and slows rolling on P-selectin but reduces capture from flow and firm arrest on IL-1-treated endothelium. J Immunol. 181, 2472-2482 (2008).
- Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J Biol Chem. 283, 15816-15824 (2008).
- Enders, S., Bernhard, G., Zakrzewicz, A., Tauber, R. Inhibition of L-selectin binding by polyacrylamide-based conjugates under defined flow conditions. Biochim Biophys Acta. 1770, 1441-1449 (2007).
- Prabhakarpandian, B., Goetz, D. J., Swerlick, R. A., Chen, X., Kiani, M. F. Expression and functional significance of adhesion molecules on cultured endothelial cells in response to ionizing radiation. Microcirculation. 8, 355-364 (2001).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunology. 2, 9 (2001).
- Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. Precise control of cell adhesion by combination of surface chemistry and soft lithography. Adv Healthc Mater. 2, 95-108 (2013).
- Qian, T., Wang, Y. Micro/nano-fabrication technologies for cell biology. Med Biol Eng Comput. 48, 1023-1032 (2010).
- Biswas, A., Bayer, I. S., Biris, A. S., Wang, T., Dervishi, E., Faupel, F. Advances in top-down and bottom-up surface nanofabrication: techniques, applications & future prospects. Adv Colloid Interface Sci. 170, 2-27 (2012).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21, 27-40 (2000).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomed Microdevices. 10, 585-595 (2008).
- Rosano, J. M., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomed Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvasc Res. 80, 384-388 (2010).
- Prabhakarpandian, B., et al. Bifurcations: focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
