Fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizações (FISH) para a localização de vírus e bactérias Endosymbiotic em Plant e Insect Tecidos

Resumo

Descrevemos aqui um simples fluorescência de hibridação in situ (FISH), o método para a localização de vírus e bactérias, em tecidos de plantas e de insectos. Este protocolo pode ser estendido para a visualização de mRNA em toda montagem e cortes microscópicos.

Resumo

Hibridização fluorescente in situ (FISH) é um nome dado a uma variedade de técnicas vulgarmente utilizadas para a visualização de transcritos de genes em células eucarióticas e pode ser ainda modificado para visualizar os outros componentes da célula, tais como a infecção com os vírus e as bactérias. Localização espacial e visualização de vírus e bactérias, durante o processo de infecção é um passo essencial que complementa a expressão profiling experiências como microarrays e RNAseq em resposta a diferentes estímulos. Compreender as infecções espaço-temporais com esses agentes complementa experiências biológicas destinadas a compreender a sua interação com componentes celulares. Várias técnicas para visualizar os vírus e as bactérias, tais como sistemas de gene repórter ou métodos imuno-histoquímicos são demoradas, e alguns estão limitados a trabalhar com organismos modelo e as metodologias complexas. PEIXES que tem como alvo de RNA ou DNA de espécies na célula é um me relativamente fácil e rápidoCTO para o estudo de localização espaço-temporal de genes e para fins de diagnóstico. Este método pode ser robusto e relativamente simples de implementar quando os protocolos empregar curto hibridação, as sondas comercialmente adquiridos, que não são caros. Isto é particularmente robusto, quando a preparação da amostra, a fixação, a hibridação, e a visualização microscópica não envolvem etapas complexas. Aqui nós descrevemos um protocolo para a localização de bactérias e vírus em tecidos de insetos e plantas. O método baseia-se na preparação simples, a fixação, e hibridação de insectos montagens inteiras e órgãos ou partes de plantas dissecadas feitos à mão, com 20 pares de bases de DNA sondas curtas conjugados com corantes fluorescentes na sua 5 'ou 3'. Este protocolo foi aplicado com sucesso a um número de tecidos de insecto e vegetais, e pode ser usada para analisar a expressão de ARNm ou de outras espécies de RNA ou de DNA na célula.

Introdução

Ao estudar as interacções entre os vírus de plantas e outros organismos patogénicos com as suas plantas hospedeiras infectadas, é importante para visualizar os patógenos e seus respectivos ácidos nucleicos in situ, independentemente de causar efeitos negativos sobre os seus hospedeiros. Isto é muito importante quando se estuda o movimento patógeno dentro e entre as células de plantas. Localização in situ de produtos de genes do agente patogénico é um passo essencial que complementa outras abordagens para estudar o processo de patogenicidade. Muitos patógenos de plantas, principalmente os vírus, são transmitidas por insetos, com interações complexas ....

Protocolo

1. Preparativos Geral Whitefly, Flora, e vírus para análise FISH

1. B traseiro e Q whiteflies biótipo de plântulas de algodoeiro (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) e manter dentro de gaiolas à prova de insetos e salas de crescimento sob condições padrão de 25 ± 2 ° C, 60% de umidade relativa, e uma luz de 14 horas / fotoperíodo escuro de 10 horas.
2. Executar PCR para testar a infecção com endosimbiontes utilizando iniciadores específicos de endossimbiontes como anteriormente descrito ^15-19.
3. Compre mudas de tomate (Solanum esculentum cv. Beefsteak) a partir de um viveiro comercial ou de plantas de tomate s....

Resultados

O sistema estudado neste manuscrito é mostrado na Figura 1 e inclui uma planta infectada com TYLCV, um adulto e uma ninfa da mosca branca B. tabaci, ea anatomia interna da mosca-branca, mostrando o caminho para a translocação TYLCV no inseto. Figura 2 mostra dupla FISH em uma mosca adulta para o simbionte primário Portiera eo simbionte secundário Arsenophonus. Figura 3 mostra dupla FISH para Portiera e Hamiltonella e .......

Discussão

O protocolo aqui descrito para a localização de um vírus de plantas, na sua planta hospedeira e vector de insecto, bactérias e endosymbiotic no seu hospedeiro mosca branca específico, pode ser adaptado para a localização de outros vírus em plantas e até mesmo em tecidos animais. Além disso, o protocolo pode ser utilizado para localizar bactérias endosymbiotic e patogénicos e outros micro-organismos em sistemas de plantas e animais. Os métodos descritos dependem de conceito simples de hibridação entre uma sonda de DNA fl.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Marcado com fluorescência Sondas	Metabion	20 bp HPLC purificada	Sequência projetada pelo cliente
Azul de toluidina	Sigma-Aldrich	89640
Dodecil Sulfato de Sódio	Sigma-Aldrich	L3771	Grau de Biologia Molecular
Formamida	Sigma-Aldrich	F9037	Grau de Biologia Molecular
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941	Grau de Biologia Molecular
Ácido Acético Glacial	Sigma-Aldrich	320099	Bloqueador
Molecular	Ted Pella Inc.	22309

de Líquido de Grau de Biologia