VIGS-medierad Forward Genetics Screening för Identifiering av gener involverade i Nonhost Resistance

Summary

Virus-inducerad geners uttryck är ett användbart verktyg för att identifiera gener som är involverade i nonhost motstånd växter. Vi visar användningen av bakteriella patogener som uttrycker GFPuv i att identifiera gen tystas växter som är mottagliga för nonhost patogener. Denna metod är enkel, snabb och underlättar storskalig screening och liknande protokoll kan användas till att studera olika andra växt-mikrob-interaktioner.

Abstract

Nonhost sjukdomsresistens av växter mot bakteriella patogener styrs av komplexa försvar vägar. Att förstå denna mekanism är viktig för att utveckla hållbara sjukdomen-resistenta växter mot många olika patogener. Virus-inducerad geners uttryck (VIGS)-baserad framåt genetik screening är en användbar metod för identifiering av gener växters försvar överförande nonhost motstånd. Tobacco rattle virus (TRV)-baserade VIGS vektorn är den mest effektiva VIGS vektor hittills och har effektivt använts att tysta endogena målgener i Nicotiana benthamiana.

I detta manuskript, visar vi en framåt genetik screening för att tysta av enskilda kloner från ett cDNA-bibliotek i N. benthamiana och mäta effekten av genen tystas växter för äventyras nonhost resistens mot nonhost patogener, Pseudomonas syringae pv. tomat T1, P. syringae pv. GlycInea, och X. campestris pv. vesicatoria. Dessa bakteriella patogener är konstruerade för att uttrycka GFPuv protein och deras gröna fluorescerande kolonier kan ses av blotta ögat under UV-ljus i nonhost inokulerade patogener växter om det tystade målgenen är involverad i att förmedla nonhost motstånd. Detta underlättar tillförlitlig och snabbare identifiering av genen tystas växter som är mottagliga för nonhost patogener. Vidare kan lovande kandidat gen informationen vara känd genom sekvensering insatsen växtgen i TRV vektor. Här kan vi visa den höga genomströmningen förmåga VIGS-medierade framåt genetik för att identifiera gener som är involverade i nonhost motstånd. Ungefär, kan 100 cDNA individuellt tystas i cirka två till tre veckor och deras relevans i nonhost resistens mot flera nonhost bakteriella patogener kan studeras i en vecka därefter. I detta manuskript, räkna vi de detaljerade stegen i denna screening. VIGS-medierad framåt genetik screening tillvägagångssätt kan utökas inte bara att identifiera gener som är involverade i nonhost motstånd, men också för att studera gener överförande flera biotiska och abiotiska stressfaktorer toleranser i olika växtarter.

Introduction

Nonhost resistans är resistansen hos alla växtarter mot raser av en viss patogen ^1,2. Detta ger ett brett spektrum och tålig sjukdomsresistens hos växter ^2,3. Men dess mekanism, särskilt mot bakteriella patogener, inte förstått ^4. Screening för mutanter eller tystade växter som kompromiss nonhost motstånd och hög genomströmning avskrift profilering för identifiering av differentiellt uttryckta gener under nonhost resistens ^5-9 är två viktiga metoder som tidigare använts för att dissekera bakteriell nonhost motstånd. Eftersom nonhost motstånd styrs av en komplex mekanism (er) ⁴ med medverkan av många gener, en hög genomströmning funktionell genomikaspekter för genidentifiering är avgörande för att bättre förstå den nonhost resistensmekanismen (s).

Virus-inducerad geners uttryck (VIGS) har framgångsrikt använts för att tysta endogen anläggninggener i många växtarter ^10,11. Nicotiana benthamiana är en av de bäst lämpade växter för VIGS ^10,12 och dess förslag arvsmassa finns nu ^13. Tobacco rattle virus (TRV)-baserade VIGS har i stor utsträckning använts som reverse genetics verktyg att karakterisera gener som är involverade i nonhost motstånd ^2,4,14. Detta VIGS vektorer och derivat finns nu tillgängliga via Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC, http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ). VIGS har också använts som en framåt genetik verktyg för att identifiera gener involverade i växt immunitet ^15-17, speciellt nonhost motstånd ^6,18. Uppskatta överkänsliga svaret (HR)-förmedlad celldöd inducerad av växter mot en specifik nonhost patogen och bedöma sjukdomen inducerad celldöd finns två stora analyser huvudsakligen används för identifying mottagliga genen tystas växter. Dock är HR celldöd inducerad endast mot typ-II nonhost patogener och inte mot typ-I nonhost patogener ^2. Därför kan HR-analyser inte allmänt används för att identifiera nonhost motstånd strategier som används av växter, speciellt mot många olika typ-I-nonhost patogener. Dessutom gör partiell förlust av nonhost motstånd i en tyst gen anläggning inte alltid leda till sjukdomssymptom ⁶ och därmed sjukdomen scoring kan inte användas för att identifiera växter kompromissa nonhost motstånd. I motsats, bedöma tillväxten av nonhost patogener i de tystade genen växterna är en bättre metod för att studera förlusten av nonhost motstånd i genen tystas växter.

Jämfört med konventionell tillväxt analys ^6,19, en snabbare metod för att bedöma nonhost bakterietillväxt på de tystade genen växter kan förkorta tiden som krävs för framåt genetik screening. Vi rapporterade tidigare en metod för att observation bakterierl patogen tillväxt på blad från blotta ögat under ultraviolett (UV) ljus med hjälp av bakterier som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) ^19. I detta manuskript vi demonstrera användbarheten av GFPuv uttrycka nonhost bakteriella patogener för enkel identifiering av genen tystas växter som äventyras för nonhost motstånd. Denna metod är exakt för identifiering av mottagliga växter och lämpade för high throughput screening.

Protocol

Ett. Växternas tillväxt och Target geners uttryck Plantera tillväxtbetingelser: Sugga N. benthamiana frön på marken mindre ingjutning blandning, Metro-Mix 350 och gror fröna i en tillväxt kammare. Varje annan jord eller jord-mindre mediet kan också användas i stället för Metro-Mix. Transplant tre veckor gamla plantor i enskilda krukor och odla dem i ett växthus som hölls vid 21 ± 2 ° C tillsammans med andra tillväxtfaktorer villkor som beskrivs i tidigare litteratur…

Representative Results

Större Syftet med denna studie är att demonstrera en metod för enkel och korrekt identifiering av genen tystas N. benthamiana växter som äventyras för nonhost motstånd. Det finns fyra viktiga steg i denna metod. Första steget är att individuellt tysta stort antal gener med TRV-VIGS. Vi hade tystats omkring 5.000 gener 6,18 under en period av cirka 1,5 år med det protokoll som visas i figur 1. Några av de tystade genen växterna visade olika fenotypiska förändringar inklu…

Discussion

Växt immunitet begränsar tillväxten av nonhost patogener och därmed ringa eller ingen grön fluorescens utsänds från vektorstyrning växtblad inokuleras med nonhost patogen enligt långvågigt UV-ljus (Figur 3D). Men när en gen som är involverad i nonhost motstånd tystas, genen tystade växter gynnar tillväxten av nonhost patogen och grön fluorescens ses (Figur 3E). Detta är den grundläggande principen involverad i den metod som beskrivs i detta manuskript. Denna metod har …

Materials

Name of the reagent/equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
96-well U-bottom plates	Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)	35-3077
96-pin replicator stainless steel	Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)	250520
High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap	Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)	6283K50	Manufacturer ID 95-0127-01
Stuart SC6 colony counter	Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK	SC6PLUS
Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350	SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)
Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)	Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)	Custom synthesized
MES, Monohydrate	VWR international (Radnor, PA, USA)	CAS No. 145224-94-8
Acetosyringone (Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)	Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)	VIS-30