O<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Cut-aberto vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Com Fluorometria

Michael W. Rudokas; Zoltan Varga; Angela R. Schubert; Alexandra B. Asaro; Jonathan R. Silva

doi:10.3791/51040

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

O

17.9K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/51040

⸱

11 de março de 2014

Michael W. Rudokas¹ , Zoltan Varga¹ , Angela R. Schubert¹ , Alexandra B. Asaro¹ , Jonathan R. Silva¹

¹Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis

Neste artigo

Resumo

A abordagem lacuna vaselina cut-aberto é usado para obter baixos gravações de ruídos de correntes iônicas e gating de canais iônicos dependentes de voltagem expressos em oócitos de Xenopus com alta resolução de cinética de canais rápidos. Com modificações menores, fixador de tensão fluorometria pode ser acoplado com o protocolo do oócito corte aberto.

Resumo

A vaselina oócito lacuna cut-aberto (COVG) técnica braçadeira de tensão permite a análise das propriedades eletrofisiológicas e cinéticos de canais iônicos heterólogas em oócitos. Gravações do setup cut-aberto são particularmente úteis para a resolução de correntes de baixa magnitude gating, rápida ativação corrente iônica e desativação. As principais vantagens sobre a tensão de dois eléctrodos de aperto (TEVC) técnica incluem o aumento da velocidade de fixação, uma melhor relação sinal-ruído, e a capacidade de modular o intracelular e meio extracelular.

Aqui, nós empregamos o canal de sódio cardíaco humano (HNA _V 1.5), expressa em oócitos de Xenopus, para demonstrar a configuração cut-aberto e protocolo, bem como as modificações que são necessárias para adicionar capacidade de fluorometria braçadeira de tensão.

As propriedades dos canais iônicos de ativação rápida, como HNA _V 1.5, não pode ser totalmente resolvido em temperatura ambiente usando TEVC, em which, a totalidade da membrana do oócito é apertado, tornando difícil o controlo da tensão. No entanto, na técnica de corte-aberto, o isolamento de apenas uma pequena porção da membrana celular permite a fixação rápida necessária para registar com precisão cinética rápida evitando canal degradado associado com técnicas de fixação de membranas.

Em conjunção com a técnica COVG, cinética do canal de iões e propriedades electrofisiológicas pode ser ainda analisada utilizando fluorimetria fixador de tensão, onde o movimento é controlado por meio da proteína de cisteína de conjugação de fluoróforos extracelularmente aplicadas, a inserção de proteínas fluorescentes codificados geneticamente, ou a incorporação de aminoácidos não naturais na região de interesse ^1. Esta informação adicional produz informação cinética sobre rearranjos conformacionais dependentes de voltagem da proteína através de alterações no microambiente em torno da molécula fluorescente.

Introdução

Técnicas de fixação de tensão especializados permitir a gravação de correntes iônicas de potenciais de membrana controladas. Amplamente utilizado braçadeira de tensão de dois eletrodos (TEVC) e técnicas de patch clamp fornecer informações eletrofisiológico confiável sobre as propriedades de muitos canais iônicos. No entanto, ambos os métodos têm desvantagens que impedem a obtenção de dados confiáveis para os canais de sódio dependentes da voltagem rápidos e outros canais de ativação rápida nas membranas, como as de oócitos de Xenopus. Os laboratórios Bezanilla e Stefani, consequentemente, desenvolveu a técnica lacuna vaselina braçadeira de tensão cut-abert....