膵神経可塑性をシミュレートする。<em>体外</em>デュアルニューロンの可塑性アッセイ
Summary
神経可塑性は、胃腸（GI）管のますます認識したが、十分に理解する機能です。ここでは、人間の膵臓疾患の例では、形態学的および機能的レベルでの消化管における神経可塑性の研究のためのin vitro神経可塑性アッセイを提示する。
Abstract
神経可塑性は、腸神経系および病理学的条件の下で胃腸（GI）神経支配の本質的な機能です。しかし、GI障害における神経可塑性の病態生理学的役割は不明である。シミュレーションと消化管神経可塑性の調節を可能にする新規実験モデルは、膵臓癌（PCA）および慢性膵炎（CP）などの特定のGI疾患における神経可塑性の寄与の強化鑑賞を可能にすることができる。ここでは、生まれたばかりのラットの後根神経節（DRG）と筋層間神経叢（MP）ニューロンを用いたin vitroの条件下で膵臓神経可塑性のシミュレーションのためのプロトコルを提示する。このデュアルニューロンのアプローチは、両方の臓器内因性および外因性神経可塑性の監視を許可するだけでなく、神経細胞やグリアの形態および電気生理学を評価するための貴重なツールを表していないだけ。また、彼らのIMPACを研究のために供給微小環境の内容の機能的調節を可能にする神経可塑性上のT。設立後は、現在の神経可塑性アッセイは、任意の消化器官における神経可塑性の研究に適用できる可能性を負いません。
Introduction
胃腸（GI）神経形態学および密度の変化は、長い間、消化器病理学者の注目を集めているが、消化管疾患の病態生理のための関連性は不明である1-3。実際、このような胃炎、逆流性食道炎、大腸炎、憩室炎、および虫垂炎のようないくつかの非常に一般的な胃腸障害は、炎症を起こした組織領域1での増加神経支配密度に関連している。しかし、本物の注目は、これまでのところ、消化管でのメカニズムと神経可塑性の意味に支払われていない。形態学的に変更された消化管神経はそれらの機能の面で、腸神経系の正常な状態、つまり 、通常の消化管の神経とは異なりますか？プラスチック腸神経における変化した神経ペプチド/神経伝達物質の含有量の意味は何ですか？周辺神経可塑性は、常に、中枢神経系に変更された信号伝達を伴うのですか？どこプラスチックextriの中心投影があるNSIC消化管神経経路？消化管神経可塑性の機能的な側面に関する知識の不足を見たときに、このような重要な質問の長いシリーズを容易に生成することができる。
機能レベルでのGI神経可塑性の研究は、有効な再現性があり、今でも容易に適用可能な実験モデルを必要とします。遺伝子操作された条件付きマウスモデル（GECoMM）の普及と受け入れの時代に、 生体内の設定で 、このような現実的な方法1でのGI神経可塑性のこれまで知られていなかった側面を解明する可能性を負うものとします。しかし、GECoMMの設計と製造コストのかかる、労働集約的で、特に、時間のかかるまま。さらに、これらは条件付きで遺伝子改変マウス（腸上皮細胞における神経成長因子/ NGFの例えばトランスジェニック過剰発現）で変調されるターゲットの事前選択が必要。したがって、DESのための成功GECoMMのIGNは、研究者は、価値のある目標のいくつかの指標（ 例えば 、以前の実験データ）を必要とする（ここでは、NGF）、対象となる分子は、少なくとも消化管の神経に何らかの生物学的に関連の効果を発揮することが期待できること、つまり 。
このような指標は、容易にインビボ系の複合体微小環境から単離された細胞サブタイプを選択的にヘテロ様式4-7に共培養することができるインビトロモデルにおいて十分に由来することができる。このような異文化環境における分子標的の変調が速く、平均して技術的にあまり面倒であり、したがって、in vivo試験での検証のための価値ある目標の事前フィルタリングを支援することができます。
最近では、膵臓内のNEの増加、神経密度と肥大をシミュレートするように設計されたイン·ビトロ神経可塑性アッセイを発表ヒト膵臓癌（PCA）および慢性膵炎（CP）の組織におけるrves。ここでは、生まれたばかりのラットの後根神経節（DRG）または筋層間神経叢（MP）に由来するニューロンは、外科的に切除されたPCaまたはCPの組織標本から組織抽出物に曝露し、正常ヒト膵臓（NP）組織抽出物5で培養されたものと比較した。代わりに、組織抽出物から、人はまた、神経可塑性に関する選択された細胞型の影響を研究するために細胞株の上清を使用することができる。標準化された形態計測測定と組み合わせることで、提示神経可塑性アッセイは、様々な膵臓微小環境に応じて、神経可塑性の有効かつ再現性のある評価を可能にする。特に、それが可能にする、神経突起伸長、およびニューロンパターン寸法を分岐し、2）機能的な神経可塑性、末梢ニューロンの興奮性の変化、すなわち変化、すなわち 1）形態学的可塑性のシミュレーション。また、周辺機器だけではなく（ つまり、 </em>腸溶）だけでなく、） 例えば、DRG又は二次脊髄（中枢ニューロンは、異なるGI組織コンテンツへの形態学的および機能的反応を評価するために、本 アッセイに含めることができる。現在のビデオチュートリアルでは、このアッセイの性能のための技術的なプロトコルを示し、その利点と弱点を議論する。さらに、我々はすべての消化器官における神経可塑性の研究にこのアッセイの基本的な概念の適用可能性に注意を引く。
Protocol
Representative Results
Discussion
この議定書は、最近、PCAとCP 5に神経可塑性のメカニズムを研究するために我々のグループが開発したin vitroでの膵神経可塑性アッセイの後ろに方法論を説明することを目的としています。プロトコルは、演奏者が、DRGとMPニューロンの単離および培養に十分な経験を得ていたら、容易に適用することができる3日間の手順を必要とする。さらに、膵臓微小環境の成分に腸およびDR…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
すべての著者は、提示アッセイの確立と検証に向けて、論文の草稿に貢献した。
Materials
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13mm coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life sciences | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Gibco/Life sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0,25% | Gibco/Life sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
Referências
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
- Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
- Demir, I. E., et al. . Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
- Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
- Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
- Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
- Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
- Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
- Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
- Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
- Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
