Fysiologiske og anatomiske teknikker demonstreres for å løse funksjon og struktur for felles proprioceptors og muskelspenninger reseptorer i krepsdyr walking lemmer.
Den primære hensikten med disse prosedyrene er å demonstrere for undervisnings-og forskningsformål hvordan å registrere aktiviteten til levende primære sensoriske nerveceller som er ansvarlige for propriosepsjon som de er å oppdage felles posisjon og bevegelse, og muskelspenninger. Elektrisk aktivitet fra krepsdyr proprioceptors og spenn reseptorer måles ved enkel nevrofysiologiske instrumentering, og en transduser blir brukt for samtidig å måle kraften som er generert ved å stimulere en motor nerve. I tillegg viser vi hvordan å farge nevroner for en rask vurdering av deres anatomiske ordning eller for permanent fiksering. Farging avslører anatomisk organisasjon som er representant for chordotonal organer i de fleste krepsdyr. Sammenligning av spenning nerve svar på de proprioceptive svar er et effektivt pedagogisk verktøy i å bestemme hvordan disse sensoriske nevroner er definert funksjonelt og hvordan anatomien er korrelert til funksjonen. Tre fargeteknikkerpresenteres slik at forskere og instruktører for å velge en metode som er ideell for sitt laboratorium.
Propriosepsjon er følelsen av lem posisjon og bevegelse som gjør det mulig koordinert motor atferd. Proprioceptors bestå av stilling (statisk) og bevegelse (kinestetiske) reseptorer. I insekter og krepsdyr, chordotonal organer er de strukturene som gir denne informasjonen til CNS en. Ikke alle chordotonal organer spenner over et felles, men de kan fortsatt overvåke felles bevegelser på grunn av deres tilknytning på apodemes (sene lignende strukturer) som spenner over leddet og beveger seg i forbindelse med skjelettmuskulatur og felles artikulasjon. Krabbe ben har seks ledd, som hver har en eller to chordotonal organer 2. Vanligvis en chordotonal organ har 60-100 eller flere sensoriske nevroner er innebygd i en elastisk tråd, nevroner som signaliserer statisk felles posisjon, retning og hastighet av bevegelse 3-6. Innspillene fra chordotonal organer i alle ledd og ben blir så sentralt behandlet slik koordinerte bevegelser av dyret.
<p class="jove_content"> De kreftene som beinmuskulaturen produserer under isometrisk og isoton sammentrekninger blir oppdaget av spenning reseptorer forbundet med muskelfibre og deres vedlegg til apodemes7-9. I krepsganglegg protokoller som følger vil vi presentere metodikk for opptak fra primære sensoriske nevroner som overvåker propriosepsjon og nervecellene som reagerer på kreftene som genereres av muskelfibre. En teknikk for aktivering benbevegelser og kvantifisering av styrkegenerering blir også presentert, samt anatomiske teknikker som kan brukes til å karakterisere anordningen av disse perifere nervesystem strukturer.Prosedyrene demonstrert under aktivere strukturell og funksjonell analyse av nevroner som innerverer begge typer reseptorer i forhold til deres plassering på en chordotonal elastisk tråd og apodeme. For å illustrere, bruker vi propodite-dactylopodite (PD) chordotonal organ, det organ som spenner over distal mest segment av krabbe etappe tre.Selv om detaljerte elektrofysiologiske studier begynte i 1930 og er fortsatt blir utført i dag, har noen aspekter blitt kjent om segmentell sammenhenger av proprioceptors i de ulike leddene og deres roller i samordnet kontroll av muscles10-16. Etablering av struktur-funksjon forholdet mellom de proprioceptive organer, muskler og nervesystemet vil ytterligere bidra til å definere disse rollene. For eksempel vil merking av somata og distale avslutninger av spenning nevroner satt inn i apodeme avsløre deres plassering i forhold til muskelfibre 8,17-21.
Vi presenterer tre fargeteknikker for krepsdyr ben som kan brukes i forskning eller faglig laboratorier. Metylenblått farging gir kontrasten for muskler og nerver, og anbefales som en enkel teknikk for elevene å lære anatomi. Labs som har fluorescens mikros oppsett kan utrette mer selektiv nevronale farging av kort utsette nerves til det vitale fargestoff 4-di-2-ASP. Det tredje alternativet er CoCl para tilbakefylling, som flekker og fikser nervecellene, og krever ikke fluorescens bildebehandling. Selv om det er arbeids-og tidkrevende, gir dette farging prosessen høy kontrast og spesifisitet for nervene som er fylt. Sammen disse teknikkene kan anvendes for å sammenligne forskjellige chordotonal organer, ikke bare i løpet av et lem eller mellom lemmene, men også hos andre krepsdyr og insektarter 20-22. Blå krabber (C. sapidus) brukt i fysiologiske innspillinger og for anatomisk flekker er lett tilgjengelig over hele Sør-og Sørøst-grensen til USA. Denne arten fungerer som en representant for de chordotonal og spenning nerve ordninger som finnes i de fleste krabber. Laboratorier på vestkysten vil foretrekke å bruke den mye større Dungeness krabbe (Cancer magister) for disse eksperimentene.
Hensikten med dette sett av eksperimenter er 1) å lære og oppviser de grunnleggende prinsipper for ekstracellulære opptak fra et identifiserbart proprioseptive organ og spenning nerve og 2) for å understreke betydningen av anatomiske kartlegging i forbindelse med fysiologisk funksjon av bestemte sensoriske systemer. Dette eksperimentell tilnærming og dyremodeller benyttes er billig og relativt enkelt å gjennomføre i nevrofysiologi undervisning laboratorier.
Nervecellene i chordotonal organer er av to spesifikke funksjonelle typer, de som reagerer på bevegelsen og de som svarer til statiske posisjoner. Encellete opptak fra en rekke chordotonal organer, uansett hvilken felles er undersøkt, har vist at dette er tilfelle 3,5. Faktisk chordotonal organer knyttet til antennal leddene hummer avsløre de samme to sensoriske typer og grunnleggende anatomi 27. I tillegg til at det finnes to typer nervecellen (bevegelse og posion), nervecellene har samme anatomiske arrangement på de respektive elastiske tråder. Den store somata plassert proksimalt på strand tendens til å tilhøre de dynamiske bevegelsessensitive nevroner. Nevroner som signaliserer statiske posisjoner har liten somata og ligger distalt. Disse cellene er tonically aktive. PD joint bare inneholder en enkelt chordotonal organ, mens det er to chordotonal organer i carpus-propodus (CP) og Merus-carpus (MC) leddene.
Disseksjon å eksponere proprioseptive strukturer i blå krabber (C. sapidus) for elektrofysiologisk registrering krever en strategi som gjør at felles bevegelser skal skje i de naturlige posisjoner mens du tar opp fra sensoriske nerveceller. Spenningen nerve for åpneren muskelen i gang benet er en meget fin nerve består av flere neuroner. Dersom forsiktighet er tatt, spenningen nerve så vel som den motor nerve innervating muskelen skal stimuleres, kan bli skadet under denne disseksjon. Foroptimalt opptak av suge elektroder må tilpasses til størrelsen av den nerven. Innspillinger er lett tilgjengelig i en student laboratorium med en 30-40X forstørrelse dissekere mikroskop og low-end micromanipulators.
Fremtidige eksperimenter som ville være interessant å forfølge med felles chordotonal organer ville være å undersøke de strukturelle og fysiologiske profiler under beinet regenerering hos ulike arter på ulike stadier i livsløpet som en oppfølging til en innledende studie som brukte Cancer magister 19,26 . Spørsmål som gjenstår å bli adressert er en) gjør fordeling og organisering av regenerert nevroner avhenge av alderen på dyret ved regenerering av et lem, 2) er de aksonale fremført til CNS (ventrale nerve ledningen) i en oppkvikkende lem funksjonell eller gjør det ta tid og felles bruk for å etablere funksjonelle forbindelser, og 3) hva som skjer med de avkuttede axoner proksimale til autotomy planet når lem er Autotomized? 28
Krepsdyr er i samsvar med miljøforhold og deres omkringliggende temperatur, men det er uklart hvordan de opprettholder koordinering innenfor en nevral krets som nevroner endre sin aktivitet i respons på temperaturendringer. En langsom hastighet på endring kan tillate dyret noen tid for akklimatisering mens en rask endring kan not29, 30.. Fysiologiske endringer i pH eller osmolaritet på grunn av stoffskiftet, atferd 31, eller miljøpåvirkning kan presentere lignende utfordringer til nevrale kretser som er involvert i propriosepsjon. Disse krepsdyr preparater er ideelle for å ta opp slike problemer fordi deres funksjon er også karakterisert ved en enkelt celle-nivå.
I denne protokollen har vi demonstrert den fysiologiske betydningen av spenning nevroner i overvåking kraft generert av åpneren muskelen. Disse spenn reseptorer kan spores tilbake til sin plassering i apodeme ved hjelp av fargingsprosedyrer. Dissenevroner, som i pattedyr, oppdage kraft på ulike nivåer og rekruttere flere nevroner som kraft øker. Frekvensen i aktivitet er relatert til stimulering frekvensen til motor neuron inntil metning i mottaket er nådd. Ved hjelp av en quick release protokoll med bøyd dactylus felles, spenning aktivitet forsvinner raskt, men deretter returnerer Når pasienten igjen spenning i en fullt utvidet felles. Dette er en klassisk eksperimentell prosedyre for å illustrere den kraft som måles av strekk reseptorer. Forskjellige neuromodulators kan anvendes ved fremstillingen for å se hvordan dette påvirker utvikling av kraft og neuronal respons. Ett av de viktige aspekter er slik neural responser bearbeides og integreres i det sentrale nervesystemet, og deres innvirkning på aktiviteten av motoriske nevroner. Teknikkene vi har vist at en til å begynne å ta opp mer informasjon om spenningen (sensorisk) nerve-motor nevron kretsen funksjon, dvs. signal i en intakt beinet til ganglion og tilbaketil muskelen.
De farvningsprosedyrer demonstrert er nøkkelen til å forstå fysiologi av sensoriske nevroner som innerverer proprioceptive organer. Anatomiske arrangement av nervecellene basert på funksjon og størrelsen av soma er like i de forskjellige chordotonal organer i krabbe. Det er ikke kjent om lignende nevrale ordninger er også funnet i andre krepsdyrarter eller insekter. Kombinere fysiologiske opptak fra enkeltceller og kartlegge plasseringen tillater direkte struktur funksjon relasjoner. Den langsiktige bevaring av anatomisk ordning med CoCl para flekker og fiksering gjør det mulig å gjentagelser gjøre tiltak og vurdere de strukturelle ordningen.
Propriosepsjon og spenning mottak av skjelettmuskulaturen er sensoriske modaliteter som gjør det mulig koordinert atferd og reaksjoner på ytre og indre miljø for rammestyrte dyr i en rekke av skjelettmuskulatur konfigurasjons. Muskelen reseptor orgel i magen av kreps er en annen veldokumentert preparat (se Crawdad prosjekt; http://www.crawdad.cornell.edu/ ) for undervisningsformål propriosepsjon med bare to nerveceller per abdominal hemi-segmentet 23 . Å kunne ta opp fra enkeltnerveceller til sensoriske nervebunter gir ytterligere detaljer som hjelpemiddel i å forstå de grunnleggende prinsippene for sensorisk mottak. Disse relativt enkle krepsdyr forberedelser tillater en å løse grunnleggende aspekter av propriosepsjon og spenning overvåking, med potensial til å bestemme de nevrale kretser som muliggjør sentrale integrering av proprioseptive og andre sanseinntrykk 9-12, 32, 33.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er takknemlige for de kunstneriske bidragene fra Hyewon Cooper.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
HEPES acid | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
HEPES base | Sigma | ||
D-Glucose | Sigma | G7021 | |
MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
Bouin’s solution fixative | Sigma | HT10-1-32 | Caution: Hazardous material (Special shipping cost required) |
CoCl2 | Sigma | Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations. | |
Methylene blue chloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide | |
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
Materials | |||
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | Any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Force transducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | Any company | ||
Glass tools | Make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | Any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | Any company | ||
Wax or modeling clay | Any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | Local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size |