Эта процедура демонстрирует в естественных условиях ближней ИК флуоресценции визуализации коллаген ремоделирования деятельности у мышей, а также экс естественных окрашивания коллагенов в срезах тканей с использованием в обойме коллагена мимические пептиды, которые могут быть фото-срабатывает для гибридизации с денатурированным коллагеновых нитей.
Коллаген является важнейшим структурным компонентом внеклеточного матрикса, который поддерживает образование тканей и технического обслуживания. Хотя коллаген ремоделирования является неотъемлемой частью нормального обновления тканей, чрезмерное количество ремоделирования деятельности участвует в опухолях, артрит, и многих других патологических состояний. Во коллагена ремоделирования, тройка спиральная структура молекул коллагена нарушается протеаз в внеклеточной среде. Кроме того, коллаген, присутствующие во многих образцов гистологических тканей частично денатурированный по фиксации и консервации процессов. Таким образом, эти денатурированные коллагеновые нити могут служить эффективными цели для биологических изображений. Ранее мы разработали клетке коллаген миметического пептида (CMP), который может быть фото-срабатывает для гибридизации с денатурированных коллагеновых нитей, образуя тройную спиральную структуру, которая является уникальной для коллагенов. Общие цели этой процедуры я) к изображению денатурированные коллагеновые нити Resulting от обычной деятельности ремоделирования в естественных условиях, и б) для визуализации коллагенов в бывших естественных условиях срезах тканей с использованием фото-срабатывает клетке CMPS. Для достижения эффективного гибридизации и успешным в естественных условиях и экс естественных изображений, флуоресцентно меченных Caged CMPS либо фото-активированный непосредственно перед внутривенной инъекции, или непосредственно активирована на срезах тканей. Нормальная скелетных коллаген remolding голым мышам и коллагенов в префиксами секциях ткани роговицы мыши изображаются в этой процедуре. Метод визуализации на основе CMP-коллагена гибридизации технологии, представленной здесь может привести к более глубокому пониманию процесса ремоделирования ткани, а также позволяет разработку новых диагностических средств для заболеваний, связанных с высоким коллагена ремоделирования деятельности.
Коллаген, самый распространенный протеин у млекопитающих, играет критическую роль в развитии и регенерации тканей, поддерживая пролиферацию и дифференцировку клеток. В то время как волокнистые коллагены (например, тип I, II), в соединительных тканях дать механическую прочность тканей, сеть, как коллаген (тип IV) образуют основную леску базальной мембраны, где клетки придают и образуют организованные ткани. Коллаген реконструкции включает в себя как разрушение коллагена (по протеаз) и синтез (продвигаемый факторов роста). Хотя коллаген ремонт, например, в кости, является частью нормального процесса обновления ткани, избыточный ремоделирования деятельности или ее возникновения в аномальных местах, как правило, указывает заживления ран ответ на травмы или хронических патологических состояний, таких как рак, остеопороз, артрит, и фиброз 1-4. Возможность напрямую изображений коллагены переживает реконструкцию в естественных условиях может привести к пониманию прогрессаион этих заболеваний, а также новые диагностики и терапии. Например, в прямом эфире изображений может предоставить информацию о серьезности и расположения заболеваний, а также может быть использован для оценки эффективности новых терапевтических агентов. Многофотонная лазерной сканирующей микроскопии и генерация второй гармоники были применены к фото фибриллярных коллагенов для мониторинга внеклеточного матрикса ремоделирования в опухоли в живых мышей 5. Тем не менее, этот метод требует животных должен быть установлен с прозрачными спинной кожных складок камер, который является инвазивной процедурой. Прямая и неинвазивной визуализации коллагена ремоделирования выиграют от зонда, который специально ориентирована коллаген проходит модернизацию. Такой зонд трудно подготовить, так как это необходимо различать ремоделирования коллагены от неповрежденных и зрелых коллагенов, которые в изобилии в нормальных тканях 6.
Коллаген состоит из чрезвычайно редких структуры белка называемой тройной спирали, котораярасщепляется протеаз, таких как матриксных металлопротеиназ (ММП) в течение коллагена ремоделирования. В расщепленных фрагментов коллагена теряют свою тройную спиральную структуру и стать развернутые нити (желатин), которые в дальнейшем перевариваются неспецифическими протеазами 1. Недавно было обнаружено, что коллаген миметический пептид (СМР), который имеет склонность к сложить в тройной спиральной структуры может специально направлены коллагеновые нити, которые в отрыве от его тройной спирали государства либо тепловой денатурации или ферментативного расщепления 1,7. Связывание в основном за счет тройной спирали гибридизации между мономерных CMPS и денатурированные коллагеновых нитей. Потому CMPS самостоятельно собираться в гомотримерную тройных спиралей при комнатной температуре с небольшим движущей силой коллагена гибридизации, в клетке CMP [(GPO), 4 NB GPO (GPO), 4, обозначенный как NB (GPO) 9, O: оксипролина], была разработана , который содержит фото-расщепляется нитробензилгруппа (NB) присоединены к центральной глицина пептида. Клетка группа NB пространственно препятствует CMP от складывания в тройной спирали, и все же, удаление клетке группы УФ-облучением сразу вызывает тройной винтовой складывания и коллагена гибридизации 1. Когда мономерные CMPS меченные ближней инфракрасной области (NIR) флюорофоры системно доставлены моделировать мышей, они могут специально предназначаться и позволяют в естественных изображений денатурированные коллагены в тканях, подвергающихся нормальным (например, в кости и хряща) и патологическое (например, в опухолях) реконструкции 1 .
Флуоресцентно меченных CMPS также может быть использован для визуализации коллагены в разделах гистологических тканей. В гистологического исследования, собранные ткани часто сохраняется фиксации сохранить клеточные компоненты и общую морфологию тканей от повреждения. Процедуры фиксации, которые включают высокую температуру, а также лечение с органическими растворителями и химического сшивающего Линкинаг реагенты (например, параформальдегид), денатурации тройной спиральную структуру коллагена 8. Это денатурации генерирует сайты для CMP гибридизации. Было показано, что флуоресцентно меченных CMPS может специфически связываться с коллагенов в разделах фиксированных тканей (например, кожи, роговицы, и кости), даже более эффективно, чем анти-антител коллагена, что позволило поспешное идентификации патологических состояний в фиброзных тканей печени 9. CMP цели денатурированные коллагеновые нити, содержащие аминокислотную последовательность тройных спиральных мотивов, который является общим для всех типов коллагенов. Поэтому CMP может рассматриваться широкого спектра окрашивание коллаген агент. Здесь мы представляем детальные экспериментальные процедуры I) визуализации денатурированные коллагеновые нити в естественных условиях и II), визуализирующих коллагенов в бывших естественных условиях срезах тканей с использованием флуоресцентно меченных клетке CMPS. NIR тег, IR680, конъюгировали к клетке CMP для живых изображений, Whilе Карбоксифлуоресцеин (CF) был использован в ткани окрашивания работы своей совместимости с стандартных флуоресцентных микроскопов. Этот протокол основное внимание уделяется применению формирования изображения CMPS по сравнению с коллагеном ремоделирования. Методы синтеза CMP можно найти в предыдущих докладах 1,7,9-15. В этом видео-докладе изображений скелетных тканей в нормальных мышей и тканевых секций мыши роговицы были выбраны для демонстрационных целей, однако методы, представленные здесь, могут быть легко применены к многих патологий и биологических моделей, включающих ремоделирование коллагена (например, опухоли, заживление ран), как а также практически к любому префиксом образца ткани, которая содержит коллагены.
Как видно в данном протоколе, поставка CMP проста, так как УФ-активация клетке CMPS является единственным дополнительным шагом к общим хвост протоколов инъекций вены 19. Ключ должен придать пептидные зонды в Uncaged и метастабильного однонитевого государства. Клетка группа предотвращает CMP от самосборки и привязки к коллагенов (рис. 2В), пока он не будет удален с помощью УФ-света и в этот момент СС начинает свертываться в тройной спирали. Формулировка для инъекций содержит цистеин, которые могут быстро реагировать с расщепленной клетке группы во время УФ-облучения для минимизации токсичности. Многочисленные мышей с различными штаммами (например СХ-1 и DR-1) были протестированы с использованием эту формулировку, и мы не обнаружили никаких поведенческих или других дефектов здравоохранения в этих мышей до шести месяцев. Если инъекция не следует сразу же после ультрафиолетового облучения, то CMPS будет сложить в гомотримерную тройных спиралей, которые не имеют гибридизации потенциала. 2С показывает крайний случай, когда перед инъекцией в CMPS были полностью повторно собранный в тройных спиралей на долгое время задержки (> 2 дня). Чтобы обойти эту проблему, решение CMP должны быть подготовлены в относительно низкой концентрации (например, ~ 40 мкм), и вводили мышам сразу после УФ-decaging. Из-за медленных темпов тройной спирали, сложив CMPS в разбавленных условиях (половина времени из рефолдинга:> 50 мин) и краткосрочной ультрафиолетового облучения и времени впрыска (5 ~ 7 мин общего), большинство CMPS поступают в кровоток в одно- прядь форму, когда этот протокол следует. После инъекций, CMPS, как ожидается, остаются в виде отдельных нитей-, а концентрация снижается на коэффициент 20 в общей крови, что приводит к резкому снижению скорости сборке 18. Если инъекции задерживается (например, из-за обращения с животными) и гомотримерную рефолдинг подозревается, что частично собранные пептиды могут быть возобновлена при нагревании выше 7076; C для диссоциации CMPS в одно-нитей, а затем быстрое охлаждение и инъекции. Хотя менее удобно, такие тепловые-диссоциирован CMPS также показывают ожидаемые результаты в естественных условиях, направленных (рис. 2, г).
В этой демонстрации голых мышей были использованы для визуализации флуоресценции NIR, потому что до 50% от сигнала NIR может быть заблокирован волос. При работе с шерстяными мышиных моделях (особенно те, с черными волосами), мы рекомендуем бритья мышь в интересующей области до визуализации с помощью электробритвы или удаления волос. На рисунке 1, есть ложные положительные сигналы от брюшной области животного, которое вызвано авто-флуоресценции хлорофилла в рацион животных. Такие фоновые сигналы могут быть значительно снижены за счет перехода мышь, чтобы очищенных диет примерно за 4 дня до съемки. Как видно на фиг.1 и 2А, существуют серьезные поглощений CMP в штопорэ. Поэтому, чтобы избежать артефактов в результате несовершенных инъекций в хвостовую вену, мы рекомендуем инъекционных в задней части хвоста, так что место инъекции не захватили в образе флуоресценции.
Меченый CMP позволяет адресно и визуализации определенных местах коллагена ремоделирования в естественных условиях, которые трудно обнаружить с помощью других методов. Например, ELISA на основе крови и мочи анализы чувствительны к расщепленных фрагментов коллагена телопептидных, но способ не может локализовать источник оборота коллагена, так как они предназначены растворимых антигенов. Основные ограничения естественных техники визуализации при помощи NIR помечены CMPS являются глубины проникновения затухание и тушение проксимальных объединили эритроцитов как гемоглобин является эндогенным жажду из 680/710 нм ЧМР красителей. Будущие приложения из КСС в естественных изображений включают ОФЭКТ или ПЭТ, используя CMPS меченные прямых гамма-излучающих радионуклидов или позитронов EMItters, для диагностики болезненных состояний, связанных с ремоделирование коллагена (например остеопороз, артрит, атеросклероз, и фиброз). Эти радио-меченных CMP аналоги устранит ограничения потери сигнала из-за глубины тканей и наличии объединенных эритроцитов, и позволит количественные измерения больные ткани. Кроме того, сравнительно поздно время визуализации (например, 48-96 HPI) в результате медленного связывания и оформления CMPS может сделать это трудно следить за быстрыми изменениями в коллагеновой ремоделирования. Такое ограничение можно преодолеть путем дальнейшего техники связывания кинетики и сродства CMP агентов воображения. С CMP связывается с денатурированные коллагены, которые имеют мало структуру, изображений CMP основе коллагена является дополнением к генерации второй гармоники микроскопии, которые могут только изображения коллагеновых волокон 5.
При окрашивании тканей секции с флуоресцентно помечены CMPS, мы обнаружили, что полезно для инкубацииОбразцы в УФ-активированный пептидных растворов при 4 ° С, так как тройной винтовой гибридизации облегчается при более низкой температуре 1,20. Было также установлено, что погружением слайдов в свежем буфере PBS в окрашивания банку является наиболее эффективным способом, чтобы смыть несвязанных CMPS, которая работает гораздо лучше, чем просто пипетки стиральные буферы над образцов. CMP-коллаген прядь гибридизации очень специфичен и надежный, поэтому просто окрашивание Протокол, представленные в этом видео может быть легко модифицированы для costaining дополнительные биомаркеров, а также для определения деградированных коллагенов в разделах незакрепленными ткани. Это эффективный и удобный альтернативой использованию анти-коллагеновых антител для детектирования волокнистых коллагены в различных гистологических образцов.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Гилберт Грин для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана грантами от NIAMS / NIH (R01-AR060484) и DOD (W81XWH-12-1-0555), присужденной SMY, и из NIH (U24 CA92871 и U54 CA151838), заключенных с MGP
IRdye 680RD Maleimide (IR680) | LI-COR | 929-71050 | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1 |
5(6)-Carboxyfluorescein | Sigma | 21877-5G-F | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12 |
Cysteine | Advanced Chemtech | YC2200 | |
Isoflurane | Butler Veterinary Supply | 4/4/5260 | |
Goat Serum | Sigma | G9023-10ML | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A9647 | |
DAPI | Roche Applied Science | 10236276001 | |
Fluoroshield mounting medium | Sigma | F6182-20ML | |
Equipment | |||
Syringes | BD | 329461 | |
UV lamp | McMaster-Carr | 1447T17 | |
Pearl impulse imager | LI-COR | 9400 | |
Surgical forceps and scissors | |||
EasyDip slide staining system | Light Labs | M900-12B | |
20-place cardboard microscope slide tray | Light Labs | ||
Cover glasses | Fisher | 12-545-c | |
Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-E |