Funktionel analyse af larve Fodring Circuit i Drosophila</i
Summary
Fodring kredsløb i Drosophila melanogaster larver serverer en simpel endnu kraftfulde model, der tillader ændringer i fodring sats at være korreleret med ændringer i stomatogastric neurale kredsløb. Dette kredsløb består af centrale serotonerge neuroner, der sender fremspring til munden kroge samt foregut.
Abstract
Serotonerge fodring kredsløb i Drosophila melanogaster-larver kan anvendes til at undersøge neurale substrater af afgørende betydning i forbindelse med udviklingen af kredsløbet. Brug den funktionelle output af kredsløbet, fodring, ændringer i neuronale arkitektur stomatogastric systemet kan visualiseres. Spiseadfærd kan optages ved at observere graden af tilbagetrækning af munden kroge, som modtager innervation fra hjernen. Lokomotorisk adfærd anvendes som fysiologisk regulering for fodring, da larver bruge deres mund kroge til at krydse over en agar substrat. Ændringer i spiseadfærd kan korreleres med axonal arkitektur af neuritter innerverer tarmen. Brug immunhistokemi er det muligt at visualisere og kvantificere disse ændringer. Forkert håndtering af larver under opførsel paradigmer kan ændre data, da de er meget følsomme over for manipulationer. Korrekt billeddannelse af neurite arkitektur innerverertarmen er kritisk for nøjagtig kvantificering af antallet og størrelsen af varicosities samt omfanget af branch noder. Analyse af de fleste kredsløb tillader kun til visualisering af neurite arkitektur eller adfærdsmæssige virkninger, men denne model giver en at korrelere den funktionelle output kredsløb med funktionsnedsættelser i neuronal arkitektur.
Introduction
Drosophila er en ekstremt kraftfuld model system til at studere neurale udvikling kredsløb grund af den hurtige generationstid, lave eksperimenterende omkostninger, og evnen til at manipulere og kontrollere genetiske og miljømæssige faktorer. Neurogenese, neuronal sti fund og synaptogenesis bevares mellem mennesker og Drosophila, derfor de mekanismer i at skabe, vedligeholde og modificere neurale kredsløb bevares så godt.
Klassiske neurotransmittere, såsom serotonin (5-hydroxytryptamin eller 5-HT) kan tjene som vækstfaktorer inden vedtagelsen af deres roller som signalmolekyler i den modne neurale kredsløb 1-3 Tidligere undersøgelser har vist, at urolig niveauer af 5-HT under embryogenese ændre tilslutning af modne neuroner 4. Andre har vist, at ektopisk anvendelse af 5-HT til dyrkede Helisoma neuroner undertrykke neuritudvækst samt synaptogenesen 5-7. I Drosophila er udviklingsmæssige 5-HT omvendt relateret til varicosity antal og størrelse samt graden af aborization, langs længden af neuritter, der rager til foregut fra CNS 8.
Serotonerg neurotransmission har vist sig at modulere fodring adfærd i forskellige arter, herunder Drosophila 8-9. Fodring kredsløb i Drosophila er et relativt simpelt kredsløb, der kan anvendes som en model til at korrelere den funktionelle udgang (fodring) med ændringer i udviklingen af axonale projektioner fra hjernen til foregut. Schoofs et al. har vist, at Drosophila larve fodring er reguleret af centrale mønster-generatorer, der påvirker muskulaturen 10. Den specifikke muskulære anatomi ikke er helt forstået, er det blevet vist, at antennal nerve, maxillary nerve, og prothoracic tilbehør nerve er ansvarlige for de muskulære mål involveret ispiseadfærd. De fleste data, der omfatter muskulaturen og nerve anatomi hvirvelløse fodring er begrænset til Calliphora larver.
Fodring på andet stadium larver kan vurderes ved tilbagetrækning af cephalopharyngeal sclerites (munden kroge), og er reproducerbar og high-throughput. De cephalopharyngeal plader innerveret af fibre fra centrale 5-HT neuroner via frontal nerve. Proventriculus eller foregut, innerveres af serotonerge fibre (recurrens nerve) at fasciculate i mellemtarmen og er ansvarlige for sammentrækninger af foregut (figur 1) 11-12. Ændringer i axonal forgrening, og antallet og størrelsen af varicosities langs neurit længde, kan kvantificeres ved hjælp af immunhistokemiske teknikker. Manipulering neuronal 5-HT under udvikling, enten direkte eller indirekte, kan ændre den funktionelle produktionen af denne fodring kredsløb, som kan vurderes og sammenholdes med ændringer i morphology af neurit arkitektur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afvigende udvikling af det serotonerge stomatogastric kredsløb, som opstår under sen embryogenese vil påvirke dens modne funktion. Ændringer i neurit arkitektur innerverer tarmen kan korreleres med den funktionelle udgang af kredsløbet, som er fodring hastighed (målt ved munden krog sammentrækninger i en gær opløsning) (figur 1). Anvendelsen af UAS-Gal4 todelte system Drosophila gør det muligt at målrette op-eller nedreguleret ekspression af et bestemt transkript til et specifikt væ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende præsidentens Research Fund fra Saint Louis University tildelt WSN
Materials
| Eclipse E-800 Microscope | Nikon Instruments | ||
| Neuroleucida | MBF Biosciences | NL-15 | Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have |
| Northern Eclipse | Empix Inc | Imaging software | |
| G-2E/C TRITC EX 528-553 | Nikon Instruments | 96312 | Filter for specific secondary antibody |
| N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded | Nikon Instruments | MRH00400 | Objective used for imaging |
| Simple Neurite Tracer | NIH Image J | http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer |
Referências
- Weiss, E., Maness, P., Lauder, J. Why do neurotransmitters act like growth factors?. Perspect Dev Neurobiol. 5, 323-335 .
- Herlenius, E., Lagercrantz, H. Neurotransmitters and neuromodulators during early human development. Early Hum. Dev. 65, 21-37 .
- Budnik, V., Wu, C., White, K. Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine. J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).
- Sodhi, M., Sanders-Bush, E. Serotonin and brain development. International Review of Neurobiol. 59, 111-174 (2004).
- Goldberg, J., Kater, S. Expression and function of the neurotransmitter serotonin during development of the Helisoma nervous system. Dev. Biol. 131, 483-495 (1989).
- Goldberg, J. Serotonin regulation of neurite outgrowth in identified neurons from mature and embryonic Helisoma triyolvis. Perspect Dev Neurobiol. 5, 373-387 (1998).
- Haydon, P., McCobb, P., Kater, S. Serotonin selectively inhibits growth cone motility and synaptogenesis of specific identified neurons. Sci. 226, 561-564 (1984).
- Neckameyer, W. S. A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit. Dev. Neurosci. 32, 217-237 .
- De Vry, J., Schreiber, R. Effects of selected serotonin 5-HT 1 and 5-HT 2 receptor agonists on feeding behavior: possible mechanisms of action. Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 341-353 (2000).
- Schoofs, A., Niederegger, S., van Ooyen, A., Heinzel, H., Spieß, R. The brain can eat: Establishing the existence of a central pattern generator for feeding in third instar larvae of Drosophila virilis and Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 56, 695-705 (2010).
- Spieß, R., Schoofs, A., Heinzel, H. Anatomy of the stomatogastric nervous system associated with the foregut in Drosophila melanogaster and Calliphora vicin third instar larvae. J. Morphol. 269, 272-282 (2008).
- Neckameyer, W. S., Bhatt, P. Neurotrophic actions of dopamine on the development of a serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster. Biomed Cent NeuroSci. 13, 26 (2012).
- Sewall, D., Burnet, B., Connolly, K. Genetic analysis of larval feeding behavior in Drosophila melanogaste. Genet. Res. 24, 163-173 (1975).
- Joshi, A., Mueller, L. Evolution of higher feeding rate in Drosophila due to density-dependent natural selection. Evolution. 42, 1090-1093 (1988).
- Budnik, V., Wu, C., White, K. Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine. J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).
- Sykes, P., Condron, B. Development and sensitivity to serotonin of Drosophila varicosities in the central nervous system. Dev. Biol. 286, 207-216 (2005).
- Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis inC. elegansand Drosophila. Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).
- McKemy, D. D. Temperature sensing across species. Pflugers Archives. 454, 777-791 (2007).
