Funksjonell analyse av larve Fôring Circuit i Drosophila</i

Summary

Fôrings krets i Drosophila melanogaster larver serverer et enkelt men kraftig modell som gjør at endringer i fôring rate å være korrelert med endringer i stomatogastric nevrale kretser. Denne kretsen består av sentrale serotonerge neuroner som sender anslag til munningen kroker samt forutgående.

Abstract

Det serotonerge matekretsen i Drosophila melanogaster larver kan brukes til å undersøke nevronale substrater av kritisk betydning under utviklingen av kretsen. Ved hjelp av den funksjonelle utgangen av kretsen, foring, endringer i neuronal arkitekturen av stomatogastric system kan visualiseres. Mate problemet kan bli registrert ved å observere graden av tilbaketrekkingen av munn kroker, som mottar innervasjon fra hjernen. Bevegelsesatferd anvendes som en fysiologisk kontroll for foring, siden larver bruker sine munn kroker for å krysse over et agar-substrat. Endringer i fôring atferd kan være korrelert med den axonal arkitekturen av neurites innervating tarmen. Ved hjelp av immunohistokjemi er det mulig å visualisere og kvantifisere disse endringene. Feil håndtering av larvene under atferds paradigmer kan endre data som de er svært følsomme for manipulasjoner. Riktig avbildning av neurite arkitektur innervatingtarmen er kritisk for nøyaktig kvantifisering av antallet og størrelsen av åreknuter, så vel som omfanget av grennoder. Analyse av de kretser tillater bare for visualisering av neurite arkitektur eller atferdsmessige effekter, men gjør det mulig for denne modellen en å korrelere den funksjonelle utgangen av kretsen med svekkelser i neuronal arkitektur.

Introduction

Drosophila er et ekstremt kraftig modellsystem for å studere neural kretsutvikling på grunn av rask generasjonstid, lav eksperimentelt kostnad og evne til å manipulere og kontrollere genetiske og miljømessige faktorer. Neurogenesis, neuronal Sti finne og synaptogenesis er bevart mellom mennesker og Drosophila, derfor mekanismene i å skape, vedlikeholde og modifisere nevrale kretser er bevart også.

Klassiske neurotransmittere, slik som serotonin (5-hydroksytryptamin eller 5-HT) kan tjene som vekstfaktorer før bruk deres rolle som signalmolekyler i den modne nevrale kretsen ^1-3 Tidligere studier har vist at opprørt nivåer av 5-HT under embryogenese endre tilkobling av modne nevroner ^fire. Andre har vist at ektopisk anvendelse av 5-HT til dyrkede neuroner Helisoma undertrykke neurite utvekst samt synaptogenesis ^5-7. I Drosophila, er utviklings 5-HT-nivåer inverst relatert til åreknute antall og størrelse, så vel som graden av aborization, langs lengden av neurites rager til forutgående fra CNS ^8..

Serotonerg neurotransmisjon har vist seg å modulere foringsoppførsel i forskjellige arter, inkludert Drosophila ^8-9. Matekrets i Drosophila er en forholdsvis enkel krets som kan brukes som en modell for å korrelere den funksjonelle utgang (foring) med forandringer i utviklingen av de aksonale projeksjoner fra hjernen til den forutgående. Schoofs et al. har vist at Drosophila larve fôring er regulert av sentrale mønstergeneratorer som påvirker muskulaturen ^10. Mens den spesifikke muskel anatomi er ikke helt forstått, har det vist seg at antennal nerve, maxillary nerve, og prothoracic tilbehøret nerve er ansvarlig for de muskuløse målene som er involvert ifôring atferd. De fleste data som involverer muskulaturen og nerve anatomi av virvelløse fôring er begrenset til Calliphora larver.

Den tilførselshastighet på annen instar larver kan vurderes ved tilbaketrekning av cephalopharyngeal sclerites (munn kroker), og er reproduserbar og høy gjennomstrømning. De cephalopharyngeal platene er innervert av fibre fra sentrale 5-HT-neuroner via frontpartiet nerve. Den proventriculus, eller forutgående, er innervert av serotonerge fibre (recurrens nerven) som fasciculate i mellomtarmen og som er ansvarlig for sammentrekninger av forutgående (Figur 1) ^11-12. Endringer i aksonal forgrening, og antallet og størrelsen av åreknuter langs neurite lengde, kan kvantifiseres ved hjelp av immunhistokjemiske teknikker. Manipulering av neuronal 5-HT under utvikling, enten direkte eller indirekte kan endre den funksjonelle resultatet av denne matekrets, som kan vurderes og korrelert med forandringer i morphology av neurite arkitektur.

Protocol

En. Vedlikehold av befolkningen Cages Oppretthold populasjons bur ved 25 ° C på en 12 timers lys-mørke-syklus. Så lenge kontroll-og forsøksgruppene er utsatt for de samme belysningsforhold, da denne teknikken kan utføres i en standard laboratorie-omgivelser. Tillate kvinner å legge egg over natten på eplesaft-agar plater. Samle nyklekkede larver ved å opprettholde platene med nylig avsatte egg ved 25 ° C i 24 timer. Plasser en liten porsjon av gjær i midten av platen for å tilt…

Representative Results

Det serotonerge matekretsen i Drosophila larven kan tjene som en ekstremt effektiv modell for å observere påvirkning av spesielle faktorer på nervesystemet utvikling. Ved kvantifisering mating hastighet, er det mulig å forbinde aksonal arkitekturen av foringskretsen med dets funksjonelle utgang (figur 1). Den lokomotoriske assay anvendes som en fysiologisk kontroll for retraksjon av munn kroker, siden larver bruker sine munn kroker til å drive seg selv på tvers av overflaten av agaren. De…

Discussion

Avvikende utvikling av serotonerge stomatogastric krets, som oppstår under sent embryogenese, vil påvirke sin modne funksjon. Endringer i neurite arkitekturen innervating tarmen kan være korrelert med den funksjonelle utgangen av kretsen, som mates hastighet (målt ved munn krok sammentrekninger i en gjæroppløsning) (figur 1). Bruken av UAS-Gal4 todelt system i Drosophila gjør det mulig å spesifikt målrette opp-eller ned-regulert ekspresjon av et bestemt transkript til et bestemt vev, e…

Materials

Eclipse E-800 Microscope	Nikon Instruments
Neuroleucida	MBF Biosciences	NL-15	Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have
Northern Eclipse	Empix Inc		Imaging software
G-2E/C TRITC EX 528-553	Nikon Instruments	96312	Filter for specific secondary antibody
N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded	Nikon Instruments	MRH00400	Objective used for imaging
Simple Neurite Tracer	NIH Image J		http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer