Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto
Summary
Este artigo descreve como um peixe-zebra adulto podem ser imobilizados, entubado, e usado para experimentos in vivo eletrofisiológicos para permitir gravações e manipulação da atividade neural em um animal intacto.
Abstract
Anteriormente, estudos eletrofisiológicos em peixe-zebra adulto têm sido limitados a fatia preparações ou para preparativos da Copa do olho e gravações electrorentinogram. Este artigo descreve como um peixe-zebra adulto podem ser imobilizados, entubado, e usado para experimentos in vivo eletrofisiológicos, permitindo a gravação da atividade neural. A imobilização do adulto requer um mecanismo para fornecer oxigênio dissolvido para as brânquias em vez de movimento bucal e opercular. Com a nossa técnica, os animais são imobilizados e perfundidos com água habitat para cumprir este requisito. Uma craniotomia é realizada sob tricaina metanossulfonato (MS-222; tricaina) anestesia para fornecer acesso ao cérebro. O eletrodo primário é então posicionado dentro da janela de craniotomia para gravar a atividade cerebral extracelular. Através da utilização de um sistema de perfusão multitubular, uma variedade de compostos farmacológicos podem ser administrados para os peixes adultos e quaisquer alterações na actividade neuronalpode ser observada. A metodologia permite não só para as observações a serem feitas em relação a mudanças na atividade neurológica, mas também permite que sejam feitas comparações entre larva e adulto zebrafish. Isto dá os investigadores a capacidade para identificar as alterações na actividade neurológica devido à introdução de vários compostos em diferentes etapas da vida.
Introduction
Neste artigo, é descrito um protocolo para a obtenção de gravações in vivo de atividade neural no peixe-zebra adulto. Métodos de gravação extracelulares são utilizados, proporcionando as medições de tensão de actividade eléctrica dentro de uma pequena região de tecido neural. Este método de investigação envolve monitorizar um grande número de células de um animal comportando 1. Anteriormente, as gravações fatia foram realizados em adultos e larvas, assim como os preparativos da Copa do olho e gravações eletrorretinograma. Estas experiências foram realizadas em grande parte ao pormenor as respostas fisiológicas de vários sistemas sensoriais 2-5. Até recentemente, as preparações cerebrais intactas foram apenas disponível para a realização de eletrofisiologia com 3,6,7 larva peixe-zebra, onde a respiração e oxigênio difusão pode ocorrer através da pele. Nossa preparação permite que a atividade neurológica nativo de um peixe-zebra adulto a ser medido, enquanto o animal permanece totalmente consciente e ciente of seus arredores.
Zebrafish (Danio rerio) desempenham actualmente um papel fundamental como um modelo para estudos genéticos, toxicológicos, farmacológicos e fisiopatológicos 3. Zebrafish ganharam visibilidade no campo da neurociência porque eles compartilham uma extensa homologia com os mamíferos nos genético, neural e endócrino níveis 8. Ao longo da última década, técnicas de imuno-histoquímica e neuroanatomic padrão foram utilizados para determinar a organização detalhada característica do sistema nervoso zebrafish 9-12 e da distribuição dos diferentes neurotransmissores 3,8,13. Mais recentemente, os pesquisadores mudaram seu foco de estudos funcionais 14,15, muitos dos quais se concentram em processos comportamentais 16-19 e características eletrofisiológicas de sistemas sensoriais 2,13,20. Um pequeno número desses estudos têm se concentrado na atividade elétrica de áreas específicas do adult cérebro zebrafish 21-23, mas não foram realizados utilizando uma abordagem em vivo.
Este protocolo pode ser adaptado para estudos eletrofisiológicos de ambos atividade espontânea e evocada no sistema nervoso do peixe-zebra para descrever os padrões de atividade em regiões específicas do cérebro. A utilização desta técnica permite que sejam feitas comparações entre a actividade neurológica dos jovens larvas e adultos. Além disso, o nosso protocolo permite comparações entre as alterações genéticas ou farmacológicas. Juntamente com outras abordagens, tais como engenharia genética, ou ensaios farmacológicos, este método oferece uma nova possibilidade para a análise funcional de comunicação e plasticidade neuronal no animal adulto intactos, bem como para aplicações potenciais, como o estudo da epilepsia de início tardio ou processos neurodegenerativos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo foi utilizado para medir a actividade neuronal do peixe-zebra adulto in vivo. Com a prática, a atividade neural pode ser observado de forma consistente, embora as características (amplitude e forma de eventos) da atividade registrada pode variar entre indivíduos. Utilização da técnica de gravação extracelular pode explicar esta observação. O método proporciona a monitorização simultânea de um grande número de células dentro de uma região de 1, assim variações no posi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH / NINDS Grant R01NS070159 (a DTM, JDL e ATS).
Materials
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
Referências
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