एक का प्रयोग न्यूमोकोकल औपनिवेशीकरण पर प्रोबायोटिक्स के प्रभाव की जांच<em> इन विट्रो</em> पालन परख
Summary
इन विट्रो में पालन assays सेल monolayers उपकला के लिए और इस तरह के न्यूमोकोकल बसाना बाधा के लिए प्रोबायोटिक्स के उपयोग के रूप में संभावित उपायों की जांच के लिए स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया की कुर्की का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
Nasopharynx के उपकला अस्तर को स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया (pneumococcus) के पालन उपनिवेशन में परिणाम कर सकते हैं और. इन विट्रो पालन assays सेल उपकला को pneumococci की कुर्की का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इस तरह के निमोनिया और ओटिटिस मीडिया के रूप में न्यूमोकोकल संक्रमण के लिए एक शर्त माना जाता है monolayers और, इस तरह प्रोबायोटिक्स के उपयोग के रूप में संभावित उपायों की जांच के लिए न्यूमोकोकल बसाना को बाधित करने के लिए. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल (कभी कभी एचईपी-2 कोशिकाओं के रूप में) मानव उपकला कोशिका लाइन सीसीएल-23 के लिए pneumococci के पालन पर प्रोबायोटिक स्ट्रेप्टोकोकस salivarius के प्रभाव की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है. परख तीन मुख्य चरण शामिल हैं: उपकला और बैक्टीरियल कोशिकाओं का 1) की तैयारी, सेल monolayers उपकला बैक्टीरिया के 2) इसके अलावा, और व्यवहार्य मायने रखता है (धारावाहिक कमजोर पड़ने और चढ़ाना) या मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR द्वारा पक्षपाती pneumococci 3) जांच ). इस टीईसीhnique अपेक्षाकृत सरल है और एक टिशू कल्चर सेटअप के अलावा अन्य विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है. परख अन्य प्रोबायोटिक प्रजातियों और / या न्यूमोकोकल उपनिवेशवाद के संभावित inhibitors परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और आसानी से न्यूमोकोकल पालन और आक्रमण के बारे में अन्य वैज्ञानिक सवालों का पता करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Introduction
स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया (pneumococcus) निमोनिया, ओटिटिस मीडिया, और मैनिंजाइटिस सहित संक्रमण पैदा कर सकता है कि एक ग्राम पॉजिटिव जीवाणु है. यह कम आय वाले देशों में बच्चों और सालाना 1 पांच साल की उम्र के तहत बच्चों के एक अनुमान के अनुसार 800,000 लोगों की मृत्यु के लिए जिम्मेदार में बीमारी का एक प्रमुख कारण है. Pneumococci अक्सर छोटे बच्चों की nasopharynx में किया जाता है. इस बसाना आम तौर पर स्पर्शोन्मुख माना जाता है, यह न्यूमोकोकल संक्रमण पछाड़ दिया और मानव आबादी 2 में बैक्टीरिया के लिए एक जलाशय के रूप में कार्य करता है. न्यूमोकोकल संयुग्म टीकाकरण को प्रभावी ढंग से वैक्सीन के भीतर निहित सीरमप्रकारों की ढुलाई कम कर देता है. हालांकि, वहाँ 90 न्यूमोकोकल सीरमप्रकारों खत्म हो गई हैं, और टीकाकरण वैक्सीन सीरमप्रकारों के उन्मूलन nonvaccine सीरमप्रकारों 3 की वजह से गाड़ी और रोग में वृद्धि के बाद है जिसके तहत सीरोटाइप प्रतिस्थापन, करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, कुछ उच्च जोखिम आबादी में, न्यूमोकोकलउपनिवेशन अक्सर पूर्व प्रथम टीका खुराक 4,5 के प्रशासन के लिए बहुत जल्दी जीवन में होता है. हाल ही में, प्रोबायोटिक्स का उपयोग न्यूमोकोकल बसाना 6,7 बाधित करने के लिए एक अतिरिक्त रणनीति के रूप में प्रस्तावित किया गया है. इन विट्रो पालन assays न्यूमोकोकल पालन 8,9 जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. ये assays न्यूमोकोकल पालन 10 पर प्रोबायोटिक लैक्टोबैसिलस rhamnosus GG (LGG) के प्रभाव की जांच करने के लिए अनुकूलित किया गया है.
LGG और अन्य लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया के अलावा, स्ट्रेप्टोकोकस salivarius, मौखिक गुहा का एक आम निवासी होने के कारण संभावित और इन विट्रो 11 में pneumococci और अन्य सांस रोगजनकों को बाधित करने की क्षमता अपनी बसाना को श्वसन तंत्र के लिए एक संभावित प्रोबायोटिक के रूप में जांच की गई है – 13. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एस के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल एक पालन परख का वर्णन न्यूमोकोकल पालन पर salivarius K12मानव उपकला कोशिका लाइन सीसीएल-23 के लिए. विकास और पालन गुणों आइसोलेट्स 10,14 के बीच काफी भिन्न हो सकती हैं परख में उपयोग करने से पहले, न्यूमोकोकल वियोजन, पालन क्षमताओं लिए मूल्यांकन किया गया. Pneumococci और एस के विकास घटता salivarius (आयुध डिपो, चित्रा 1) ऑप्टिकल घनत्व द्वारा मध्य लॉग चरण और अनुमान एकाग्रता (कॉलोनी बनाने इकाइयों या CFU / एमएल) निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया गया. यह प्रत्येक परख में उपयोग करने के लिए पहले अलग के लिए व्यवहार्य गिनती और आयुध डिपो द्वारा वृद्धि की जांच की सिफारिश की है. यह परख मानक टिशू कल्चर सुविधाओं और उपकरणों के साथ किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, एस के तीन खुराक का प्रभाव salivarius पूर्व एस के पालन पर pneumococci के अलावा करने के लिए 1 घंटे प्रशासित निमोनिया PMP843, एक nasopharyngeal झाड़ू से व्युत्पन्न एक सीरोटाइप 19F गाड़ी अलग, जांच कर रहे हैं. पक्षपाती pneumococci यों के लिए दो अलग अलग तरीके प्रस्तुत कर रहे हैं: रोकते रक्त अगर पर चढ़ानामेरा व्यवहार्य मायने रखता है, और डीएनए निष्कर्षण और qPCR 15 से न्यूमोकोकल lytA जीन का पता लगाने. बुनियादी पालन परख प्रोटोकॉल आसानी से विभिन्न खुराक या प्रोबायोटिक्स के प्रशासन के समय का परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है और भी अन्य जीवाणु उपभेदों या प्रजातियों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस परख की एक महत्वपूर्ण भाग एस की उचित मात्रा जोड़ना है वर्गों 3.1.7 और 3.1.12 में salivarius और pneumococci. सांद्रता आयुध डिपो रीडिंग का उपयोग कर रहे हैं अनुमान है लेकिन प्लेटों अगले दिन गिने जाते हैं जब तक सटीक inocula न?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम मर्डोक लड़कों की अनुसंधान संस्थान और विक्टोरियन सरकार का परिचालन बुनियादी सुविधाओं सहायता कार्यक्रम से धन के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Minimum Essential Media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30244.01 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30084.03 | ||
| T-75 Flask | Nunc | 156472 | ||
| CCL-23 cells | ATCC | CCL-23 | ||
| Trypsin | Life Technologies | 15090046 | ||
| 24-well cell culture plate | Nunc | 142475 | ||
| Horse blood agar (HBA) plates | Oxoid | PP2001 | Sheep blood agar plates also acceptable | |
| Todd-Hewitt Broth | Oxoid | CM0189 | ||
| Yeast Extract | Beckton Dickinson | 212750 | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | ||
| Disposable cuvettes | Kartell | 1938 | ||
| Heparin | Pfizer | 2112105 | comes in sterile ampules at 5,000IU/5mL | |
| sterile spreader | Technoplas | S10805050 | alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ||
| Mutanolysin | Sigma-Aldrich | M9901 | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| SDS 20% solution | Ambion | AM9820 | ||
| RNase A | Qiagen | 19101 | ||
| QIAamp DNA mini-kit (250) | Qiagen | 51306 | ||
| LytA F primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA | |
| LytA R primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT | |
| LytA probe | Eurogentec | Custom made | 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9906 | ||
| Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix | Agilent Technologies | 600880 | ||
| Thermo-Fast 96 Detection plate | Thermo Fisher Scientific | AB-1100 | ||
| Ultra clear qPCR cap strips | Thermo Fisher Scientific | AB-0866 | ||
| Mx3005 QPCR System | Agilent Technologies | 401449 | ||
| * alternative sources are available for most/all products listed | ||||
Referências
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