Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um<em> In Vitro</em> Adesão Assay
Summary
Os ensaios in vitro de adesão pode ser utilizado para estudar a ligação de Streptococcus pneumoniae a monocamadas de células epiteliais e para investigar possíveis intervenções, tais como o uso de probióticos para inibir a colonização de pneumococo.
Abstract
A adesão de Streptococcus pneumoniae (pneumococos), para o revestimento epitelial da nasofaringe pode resultar em colonização e é considerada um pré-requisito para as infecções pneumocócicas, tais como pneumonia e otite média. Ensaios in vitro de adesão pode ser utilizado para estudar a ligação de pneumococos para células epiteliais monocamadas e para investigar possíveis intervenções, tais como o uso de probióticos, para inibir a colonização de pneumococo. O protocolo aqui descrito é utilizado para investigar os efeitos do Streptococcus salivarius probiótico na aderência de pneumococos para a linha de células epiteliais humanas CCL-23 (por vezes referidas como células HEp-2). O ensaio envolve três passos principais: 1) a preparação de células epiteliais e bactérias, 2) a adição de bactérias de monocamadas de células epiteliais, e 3) detecção de pneumococos aderente por contagem de viáveis (diluição em série e plaqueamento) ou quantitativa PCR em tempo real (qPCR ). Esta technique é relativamente simples e não requer equipamento especializado, que não seja uma instalação de cultura de tecidos. O ensaio pode ser usado para testar outras espécies de probióticos e / ou inibidores potenciais de colonização pneumocócica e pode ser facilmente modificado para tratar outras perguntas científicos sobre a adesão pneumocócica e invasão.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (pneumococos) é uma bactéria Gram positiva que pode causar infecções, incluindo pneumonia, otite média, e meningite. É uma das principais causas de doenças em crianças em países de baixa renda e responsável por cerca de 800.000 mortes de crianças menores de cinco anos de idade anualmente 1. Os pneumococos são freqüentemente realizadas na nasofaringe de crianças pequenas. Embora esta colonização é considerado geralmente assintomática, que precede a infecção por pneumococos e serve como um reservatório para as bactérias em duas populações humanas. Vacinação conjugada pneumocócica reduz eficazmente o transporte dos serotipos contidos na vacina. No entanto, existem mais de 90 serotipos de pneumococos, e a vacinação pode levar à substituição do serotipo, em que a eliminação dos serotipos da vacina é seguido por um aumento no transporte e doença causada por serotipos nonvaccine 3. Além disso, em algumas populações de alto risco, pneumocócicacolonização frequentemente ocorre muito cedo na vida, antes da administração da primeira dose de vacina de 4,5. Recentemente, o uso de probióticos tem sido proposta como uma estratégia adicional para inibir pneumocócica 6,7 colonização. Ensaios in vitro de adesão foram usadas para examinar a aderência pneumocócica 8,9. Estes ensaios foram adaptados para investigar o impacto do probiótico Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) na aderência pneumocócica 10.
Além LGG e outras bactérias de ácido láctico, Streptococcus salivarius, residente comuns da cavidade oral, tem sido investigada como um probiótico potencial para o tracto respiratório devido ao seu potencial de colonização e a capacidade para inibir a pneumococos e outros patogénicos respiratórios in vitro 11 – 13. O protocolo aqui apresentado descreve um ensaio de aderência utilizado para investigar os efeitos de S. salivarius K12 na adesão pneumocócicapara a linha de células epiteliais humanas CCL-23. Antes de ser utilizado no ensaio, pneumococos isolados foram avaliadas por capacidades de adesão, como o crescimento e as propriedades de aderência pode variar entre substancialmente isolados 10,14. As curvas de crescimento de pneumococos e S. salivarius foram realizados para determinar a fase mid-log e estimar a concentração de (unidades formadoras de colónias ou de UFC / mL) por densidade óptica (OD, Figura 1). Recomenda-se para analisar o crescimento de contagem viável e OD para cada isolado antes da sua utilização no ensaio. Este ensaio pode ser realizado em qualquer laboratório com equipamento de cultura de tecido padrão e equipamento. Neste protocolo, os efeitos de três doses de S. salivarius administrado 1 hora antes da adição de pneumococos na aderência de S. pneumoniae PMP843, um sorotipo 19F transporte isolado derivado de um swab de nasofaringe, são examinados. Duas formas diferentes para quantificar pneumococos aderente são apresentados: plaqueamento em agar sangue para determina contagens viáveis, e a extracção do ADN e a detecção do gene lytA pneumocócica por qPCR 15. O protocolo básico de ensaio de aderência pode ser facilmente modificado para testar diferentes doses ou o tempo de administração de probióticos e também pode ser utilizado com outras estirpes bacterianas ou de espécies.
Protocol
Representative Results
Discussion
A parte crítica deste ensaio é a adição de concentrações adequadas de S. salivarius e pneumococos nas seções 3.1.7 e 3.1.12. As concentrações são estimados usando leituras OD mas os inóculos exacta não é determinado até que as placas são contadas no dia seguinte. Por esta razão, recomenda-se realizar as curvas de crescimento para medir a OD e as contagens viáveis (CFU / ml) ao longo do tempo para todas as estirpes bacterianas usadas no teste para identificar a fase mid-log e auxiliar no …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Programa de Apoio à Infra-Estrutura Operacional do Governo de Victoria Childrens Research Institute e Murdoch.
Materials
| Minimum Essential Media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30244.01 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30084.03 | ||
| T-75 Flask | Nunc | 156472 | ||
| CCL-23 cells | ATCC | CCL-23 | ||
| Trypsin | Life Technologies | 15090046 | ||
| 24-well cell culture plate | Nunc | 142475 | ||
| Horse blood agar (HBA) plates | Oxoid | PP2001 | Sheep blood agar plates also acceptable | |
| Todd-Hewitt Broth | Oxoid | CM0189 | ||
| Yeast Extract | Beckton Dickinson | 212750 | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | ||
| Disposable cuvettes | Kartell | 1938 | ||
| Heparin | Pfizer | 2112105 | comes in sterile ampules at 5,000IU/5mL | |
| sterile spreader | Technoplas | S10805050 | alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ||
| Mutanolysin | Sigma-Aldrich | M9901 | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| SDS 20% solution | Ambion | AM9820 | ||
| RNase A | Qiagen | 19101 | ||
| QIAamp DNA mini-kit (250) | Qiagen | 51306 | ||
| LytA F primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA | |
| LytA R primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT | |
| LytA probe | Eurogentec | Custom made | 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9906 | ||
| Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix | Agilent Technologies | 600880 | ||
| Thermo-Fast 96 Detection plate | Thermo Fisher Scientific | AB-1100 | ||
| Ultra clear qPCR cap strips | Thermo Fisher Scientific | AB-0866 | ||
| Mx3005 QPCR System | Agilent Technologies | 401449 | ||
| * alternative sources are available for most/all products listed | ||||
Referências
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