التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em> في المختبر</em> و<em> في فيفو</em> لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة
Summary
التشكل العصبية والهجرة هي الأحداث الحاسمة الكامنة وراء نمو الدماغ السليم. هنا، نحن تصف أساليب التلاعب وراثيا مثقف الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ والمخيخ النامية لتقييم التشكل وخصائص المهاجرة من الخلايا العصبية.
Abstract
الأحداث التنموية في الدماغ بما في ذلك التشكل العصبية والهجرة ومدبرة للغاية العمليات. في المختبر والمجراة تحليلات تسمح لتوصيف متعمقة لتحديد مسارات المشاركة في هذه الأحداث. الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ (CGNs) التي هي مستمدة من المخيخ النامية هي نظام النموذج المثالي الذي يسمح للالتحليلات المورفولوجية. هنا، نحن تصف طريقة لكيفية التلاعب وراثيا CGNs وكيفية دراسة axono وdendritogenesis من الخلايا العصبية الفردية. مع هذا الأسلوب آثار تدخل الحمض النووي الريبي، من overexpression أو جزيئات صغيرة يمكن مقارنة للسيطرة على الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك، القشرة القوارض المخيخ هو الوصول إليها بسهولة في نظام الجسم الحي بسبب تطوره بعد الولادة الغالبة. كما نقدم لفي الجسم الحي تقنية التثقيب الكهربائي للتلاعب وراثيا في مخيخات النامية ووصف المخيخ لاحقة يحلل لتقييم مورفولوجيا الخلايا العصبية والثانية الهجرة.
Introduction
المخيخ هو نظام ممتاز لدراسة آليات النمو محوار والهجرة. وكان المخيخ موضوع الدراسات التشريحية منذ فجر علم الأعصاب 1. المجهري الحديثة والتقنيات المناعى توسعت بشكل كبير والمكرر الاكتشافات الأولية من قبل سانتياغو رامون، وكاجال 2-4. علم الوراثة الجزيئي الماوس والدراسات كشفت عوامل النمو والنسخ أساسيا في السيطرة على التنمية المخيخ، مما أدى إلى فهم أكبر من الأحداث الحاسمة اللازمة لالأسلاك المناسبة من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية بما في ذلك الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ (CGNs) 5-7.
المخيخ هو مشتق من قسيم معيني 1 من الدماغ المؤخر النامية 8. الشفة المعينية، الذي هو جزء من سقف البطين 4 الجاري، يثير المخيخ الأسلاف الحبيبية الخلايا العصبية، والتي سوف تشكل معظم سكان العديد من الخلايا العصبية فيالمخيخ الكبار 9. بعد الهجرة منقاري، يحلون في بدأة المخيخ. هنا، الانقسام السلائف الحبيبية الخلايا العصبية يؤدي إلى التوسع الهائل في الطبقة الحبيبية الخارجية (EGL)، الذي يقام بعد الولادة في القوارض. من EGL، الخلايا العصبية تبدأ الهجرة إلى الداخل من خلال طبقة الجزيئية (ML)، في الماضي طبقة الخلايا العصبية لتأخذ في نهاية المطاف الإقامة في الطبقة الحبيبية الداخلية (IGL 2). أثناء هذه العملية المهاجرة، ويكتسبون شكل ثنائي القطب مع اثنين من محاور عصبية تمتد إلى ML. وبعد مزيد من الهجرة، وجسم الخلية يهاجر بعيدا عن المحاور والعمليتين تلتحم لتشكل واحدة من شقين، على شكل حرف T محوار 10. في وقت لاحق، وهذه المحاور fasciculate ويشار إلى ألياف متوازية كما. بعد أن استقر في IGL، CGNs تنمو التشعبات، والتي تشكل مخالب شجيري لإنشاء نقاط الاشتباك العصبي مع ألياف المطحلب. لدراسة العمليات الأساسية في المخيخ النامية، مجتمعة في المختبر والمجراة في approacح يسمح لنتائج واستنتاجات موثوقة.
CGNs ليست فقط الخلايا العصبية الأكثر عددا من المخيخ ولكن من الدماغ كله، ويمكن أن يكون مثقف لدرجة عالية من النقاوة 11-13. في الثقافة، تصبح هذه الخلايا العصبية السكان متجانسة للغاية تالية للتفتل بسرعة ويكتسب التشكل القطبي مع المحاور التي يسهل التعرف عليها والتشعبات. وقد أثبتت CGNs مثقف أن يكون مفيدا للغاية لدراسة مختلف جوانب التنمية بما في ذلك انتشار العصبية السلف، والتمايز، محور عصبي والتنمية التغصنات، هجرة الخلايا العصبية، الخلايا والخصائص الكهربية (14-19 وغيرها كثير). استخدام التلاعب الجيني توسعت براعة CGNs مثقف وسمح لمزيد من التبصر الآلية في الأحداث سالفة الذكر. ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية مثقف باستخدام فوسفات الكالسيوم وانخفاض الكفاءة أو طرق محبة للدهون يليه مناعية مع علامات قطبية أو المدعومة من برامج التحليل faciliتيتس تقييم مثل مورفولوجيا الخلايا العصبية الفردية في ثقافة العصبية الكثيفة. مع هذا النهج، يمكن دراسة دور البروتينات من الاهتمام في محور عصبي أو التغصنات النمو 20-25،26-28. ولكن هذا النظام هو أقل ثقافة من المفيد تحليل الهجرة العصبية كما الهجرة محدودة جدا في الثقافات عالية الكثافة وسيتطلب cocultures. تحليل في المختبر من محور عصبي والنمو التغصنات يسمح أيضا لفحص البروتينات المترابطة لمسار الإشارات باستخدام مزيج من تدخل الحمض النووي الريبي (ط)، والإفراط في التعبير أو جزيئات صغيرة.
لتحديد أهمية البروتين من الفائدة في محور عصبي وتنظيم نمو التغصنات أو هجرة الخلايا العصبية، وفي electroporation فيفو (IVE) الأسلوب يسمح للتحليل في القشرة المخيخ النامية. نظرا لحقيقة أن التنمية في المخيخ القوارض يمتد الطريق إلى أول أسبوعين بعد الولادة، المخيخ يمثل accessibلو بنية الدماغ للتلاعب الجيني لدراسة تطوير محاور عصبية والتشعبات، والهجرة العصبية synaptogenesis، وموت الخلايا المبرمج و20-24،29،30،26،27،31-34. بالإضافة إلى ذلك، هذا النظام نموذج مفيد أيضا لجوانب أخرى للتنمية الخلايا العصبية التي تتطلب قشرة دماغ سليمة مثل محوار الاستطلاعية، والأسلاك والتواصل بين الخلايا العصبية والتفاعلات العصبية، الدبقية مجتمعة، ويوفر هذا البروتوكول في المختبر والمجراة في تقنيات لمعالجة اتباع نهج متكامل بشأن التشكل العصبية والهجرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
مزايا والقيود المفروضة على وصفها في المختبر والمجراة في أساليب:
وبنفس القدر مناسبة تماما CGNs مثقف من الماوس والفئران للالتحليلات المورفولوجية. نظرا لحجم أكبر من المخيخ الفئران، العائد من CNGs من الفئران الوليدة يفوق عدد الجرا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر N. Schwedhelm-Domeyer للحصول على مساعدة فنية ممتازة، C. المطرقة وS. Papiol للمساعدة في التحليلات الإحصائية. ويتم تمويل عملنا من قبل جمعية ماكس بلانك، جمعية الألمانية للبحوث، ومركز النانو المجهرية، وعلم وظائف الأعضاء الجزيئية من الدماغ (CNMPB)، غوتنغن، ألمانيا والتي GGNB جديد المجموعة الراتب من جامعة غوتنغن.
Materials
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isofluorane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
| SP2 confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
| Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 needle, 30 gauge | BD | 302200 | |
| 50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
Referências
- Cajal, S. R. . Histology of the nervous system of man and vertebrates. , (1995).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. , (2012).
- Palay, S. L., Chan-Palay, V. . Cerebellar cortex: cytology and organization. , (1974).
- Hatten, M. E., Alder, J., Zimmerman, K., Heintz, N. Genes involved in cerebellar cell specification and differentiation. Curr. Opin. Neurobiol. 7, 40-47 (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu. Rev. Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Sillitoe, R. V., Joyner, A. L. Morphology molecular codes, and circuitry produce the three-dimensional complexity of the cerebellum. Ann. Rev. Dev. Biol. 23, 549-577 (2007).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Kawaji, K., Umeshima, H., Eiraku, M., Hirano, T., Kengaku, M. Dual phases of migration of cerebellar granule cells guided by axonal and dendritic leading processes. Mol. Cell Neurosci. 25, 228-240 (2004).
- Hatten, M. E., Gao, W. -. Q., Morrison, M. E., Mason, C. A. Cellular and molecular neuroscience. , 419-41 .
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J. Vis. Exp. , (2009).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Rivas, R. J., Hatten, M. E. Motility and cytoskeletal organization of migrating cerebellar granule neurons. J. Neurosci. 15, 981-989 (1995).
- Kuhar, S. G., et al. Changing patterns of gene expression define four stages of cerebellar granule neuron differentiation. Development. 117, 97-104 (1993).
- Baird, D. H., Hatten, M. E., Mason, C. A. Cerebellar target neurons provide a stop signal for afferent neurite extension in vitro. J. Neurosci. 12, 619-634 (1992).
- Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. J. Neurosci. 15, 4970-4981 (1995).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Smith, T. C., Wang, L. Y., Howe, J. R. Distinct kainate receptor phenotypes in immature and mature mouse cerebellar granule cells. Physiol. 517 (1), 51-58 (1999).
- Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain). Science. 303, 1026-1030 (2004).
- Stegmuller, J., Huynh, M. A., Yuan, Z., Konishi, Y., Bonni, A. TGFbeta-Smad2 signaling regulates the Cdh1-APC/SnoN pathway of axonal morphogenesis. J. Neurosci. 28, 1961-1969 (2008).
- Stegmuller, J., et al. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-400 (2006).
- Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Nakazawa, T., Stegmuller, J. p250GAP is a novel player in the Cdh1-APC/Smurf1 pathway of axon growth regulation. PLoS One. 7, (2012).
- Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Stegmuller, J. The E3 ligase Cdh1-anaphase promoting complex operates upstream of the E3 ligase Smurf1 in the control of axon growth. Development. 139, 3600-3612 (2012).
- Gaudilliere, B., Konishi, Y., de la Iglesia, N., Yao, G., Bonni, A. A. CaMKII-NeuroD Signaling Pathway Specifies Dendritic Morphogenesis. Neuron. 41, 229-241 (2004).
- Yang, Y., et al. A Cdc20-APC ubiquitin signaling pathway regulates presynaptic differentiation. Science. 326, 575-578 (2009).
- Litterman, N., et al. An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning. PLoS Biol. 9, (2011).
- Kim, A. H., et al. A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons. Cell. 136, 322-336 (2009).
- Shalizi, A., et al. A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation. Science. 311, 1012-1017 (2006).
- Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration. PLoS One. 8, (2013).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nat. Neurosci. , (2011).
- Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).
- Huynh, M. A., et al. An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain. Neuron. 69, 930-944 (2011).
- de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain. Neuron. 72, 22-40 (2011).
- Calissano, P., et al. Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).
