Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em> In Vitro</em> Et<em> In Vivo</em> À étudier neuronale Morphologie et migration
Summary
Morphogenèse neuronale et la migration sont des événements cruciaux qui sous-tendent le développement normal du cerveau. Ici, nous décrivons des méthodes pour manipuler génétiquement les neurones granulaires du cervelet en culture et le cervelet en développement pour l'évaluation de la morphologie et les caractéristiques de migration des neurones.
Abstract
Événements de développement du cerveau, y compris la morphogenèse neuronale et la migration sont des processus très orchestrés. In vitro et in vivo analyses permettre une caractérisation approfondie pour identifier les voies de signalisation impliquées dans ces événements. Neurones granulaires du cervelet (CGN) qui sont dérivées à partir de cervelet de développement sont un système de modèle idéal qui permet des analyses morphologiques. Ici, nous décrivons une méthode de comment manipuler génétiquement CGN et comment étudier axono et dendritogénèse des neurones individuels. Avec cette méthode, les effets de l'interférence de l'ARN, la surexpression ou de petites molécules peuvent être comparées pour contrôler les neurones. En outre, le cortex cérébelleux de rongeur est un endroit facilement accessible dans le système in vivo en raison de son développement postnatal prédominant. Nous présentons également une technique in vivo dans d'électroporation à manipuler génétiquement le cervelet en développement et décrire cérébelleuse analyses ultérieures pour évaluer la morphologie neuronale unee migration.
Introduction
Le cervelet est un excellent système pour étudier les mécanismes de la croissance axonale et la migration. Le cervelet a été l'objet d'études anatomiques depuis l'aube des neurosciences 1. Microscopie moderne et des techniques d'immunohistochimie ont considérablement élargi et affiné les premières découvertes de Santiago, Ramon, et Cajal 2-4. la génétique des souris et des études moléculaires ont découvert des facteurs de croissance et de transcription essentiels dans le contrôle du développement du cervelet, qui a conduit à une meilleure compréhension des événements cruciaux nécessaires au bon câblage des différents types de neurones dont les neurones granulaires du cervelet (SCT) 5-7.
Le cervelet est un dérivé d'une rhombomère du cerveau postérieur développement 8. La lèvre rhombique, qui fait partie de la toiture de la 4 e ventricule, donne naissance à des progéniteurs cérébelleux granule de neurones, qui constitueront les plus nombreux dans la population neuronalecervelet adulte 9. Après la migration rostrale, ils s'installent dans l'ébauche du cervelet. Ici, la mitose de précurseurs granule de neurones conduit à l'expansion spectaculaire de la couche granulaire externe (EGL), qui a lieu après la naissance chez les rongeurs. De l'EGL, les neurones commencent à migrer vers l'intérieur à travers la couche moléculaire (ML), au-delà de la couche des cellules de Purkinje de prendre finalement la résidence dans la couche granulaire interne (IGL 2). Au cours de ce processus migratoire, ils acquièrent une forme bipolaire avec deux axones s'étendant dans le ML. Après poursuite de la migration, le corps de la cellule migre à l'écart des axones et les deux processus fusionnent pour former une forme de fourche, axone en forme de T 10. Par la suite, ces axones fasciculées et sont appelées fibres comme parallèles. S'étant établi à l'IGL, CGN poussent dendrites, qui forment des griffes dendritiques à établir des synapses des fibres moussues. Pour examiner les processus fondamentaux dans le cervelet en développement, un combiné in vitro et in vivo approach permet des résultats fiables et conclusions.
CGN ne sont pas seulement les plus nombreux neurones du cervelet, mais de l'ensemble du cerveau et peuvent être cultivées à haute pureté 11-13. Dans la culture, cette population neuronale très homogène devient rapidement postmitotique et acquiert une morphologie polaire avec axones et des dendrites facilement identifiables. CGN culture se sont avérées extrêmement utiles pour étudier les différents aspects du développement neuronal, y compris ancêtre prolifération, la différenciation, axonale et le développement des dendrites, migration neuronale, l'apoptose et les propriétés électrophysiologiques (14-19 et bien d'autres). L'utilisation de la manipulation génétique a élargi la polyvalence de CGN culture et a permis en outre une approche mécanistique sur les événements mentionnés ci-dessus. La transfection de neurones en culture à l'aide de faible efficacité du phosphate de calcium ou lipophiles méthodes suivies par immunocytochimie avec des marqueurs de polarité ou par logiciel supporté analyse facilitertats de l'évaluation, par exemple de la morphologie des neurones individuels dans une culture neuronale dense. Avec cette approche, le rôle des protéines d'intérêt dans l'axone ou dendrites croissance peut être étudiée 20-25,26-28. Ce système de culture est toutefois moins utile d'analyser la migration neuronale que la migration est très limité dans les cultures à haute densité et exigerait co-cultures. L'analyse in vitro de l'axone et la croissance de dendrites permet également à l'examen des protéines interconnectés d'une voie de signalisation en utilisant les combinaisons de l'interférence ARN (i), la sur-expression ou de petites molécules.
Pour établir l'utilité de la protéine d'intérêt dans l'axone et la régulation de la croissance de la dendrite ou de la migration neuronale, l'électroporation in vivo (IVE) de technique permet l'analyse dans le cortex cérébelleux développement. En raison du fait que le développement cérébelleux chez des rongeurs s'étend chemin dans les deux premières semaines après la naissance, le cervelet représente un AccessiBla structure du cerveau pour le manipulations génétiques pour examiner le développement des axones et des dendrites, la migration neuronale, synaptogenèse et l'apoptose 20-24,29,30,26,27,31-34. En outre, ce système modèle est également utile pour d'autres aspects du développement neuronal qui nécessitent le cortex cérébelleux intact comme des axones, le câblage et la connectivité des neurones et des interactions neurone-glie Pris ensemble, ce protocole prévoit in vitro et des techniques in vivo pour lutter contre une approche complémentaire concernant la morphogenèse neuronale et la migration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avantages et limites de l'décrite in vitro et des méthodes in vivo:
CGN culture de la souris et les rats sont également bien adaptés pour les analyses morphologiques. En raison de la plus grande taille d'un cervelet de rat, le rendement en CNGS de bébés rats est supérieure à celle des souriceaux 3-4x. Mis à part CGN, les neurones corticaux et hippocampiques peuvent être utilisés comme système de culture. La méthode au phosphate de calcium se traduit par…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions N. Schwedhelm-Domeyer pour une excellente assistance technique, C. et S. Marteau Papiol l'aide d'analyses statistiques. Notre travail est financé par la Société Max Planck, la Deutsche Forschungsgemeinschaft, le Center for Nanoscale Microscopie et physiologie moléculaire du cerveau (CNMPB), Göttingen, en Allemagne et par la GGNB junior Groupe Allocation de l'Université de Göttingen.
Materials
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isofluorane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
| SP2 confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
| Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 needle, 30 gauge | BD | 302200 | |
| 50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
Referências
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