מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em> במבחנה</em> ו<em> בVivo</em> ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה
Summary
המורפוגנזה ונדידת נוירונים הן אירועים מכריעים שבבסיס התפתחות מוח תקין. כאן אנו מתארים שיטות לתמרן גנטי נוירונים בתרבית המוח הקטן גרגיר והמוח קטן מתפתח להערכה של מורפולוגיה ומאפייני נדידה של תאי עצב.
Abstract
אירועים התפתחותיים במוח כולל המורפוגנזה ונדידת נוירונים הם מתוזמרים מאוד תהליכים. במבחנה in vivo מנתחים לאפשר לאפיון מעמיק כדי לזהות מסלולים מעורבים באירועים אלו. נוירונים גרגיר cerebellar (CGNs) המופקים מהמוח הקטן מתפתח הם מערכת מודל אידיאלית המאפשרת לניתוחים מורפולוגיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד לתפעל גנטי CGNs ואיך ללמוד-axono וdendritogenesis של נוירונים בודדים. בשיטה זו ניתן להשוות את ההשפעות של התערבות RNA, ביטוי יתר או מולקולות קטנות כדי לשלוט בנוירונים. בנוסף, קליפת המוח הקטן המכרסם היא נגישה בקלות במערכת vivo בשל ההתפתחות לאחר הלידה הדומיננטית שלה. גם אנחנו מציגים את in vivo electroporation טכניקה כדי לתפעל גנטי cerebella לפתח ולתאר במוח קטן שלאחר מכן מנתח כדי להעריך מורפולוגיה עצביתnd הגירה.
Introduction
המוח הקטן הוא מערכת מצוינת ללמוד מנגנונים של צמיחת האקסון ונדידה. המוח הקטן כבר את הנושא של מחקרים אנטומיים משחר מדעי המוח 1. מיקרוסקופ מודרני וטכניקות immunohistochemical הרחיבו באופן משמעותי ומעודן תגליות הראשוניות על ידי סנטיאגו, רמון, וקחל 2-4. גנטיקה עכבר ומחקרים מולקולריים חשפו גורמי גדילה ושעתוק חיוניים בשליטה על התפתחות המוח הקטן, מה שהובילו להבנה טובה יותר של אירועים קריטיים דרושים לחיווט נכון סוגים שונים של תאי עצב, כולל נוירונים במוח קטנים גרגיר (CGNs) 5-7 של.
המוח הקטן הוא נגזר של rhombomere 1 של המוח האחורי פיתוח 8. השפתיים rhombic, שהוא חלק מהגג של חדר 4 ה, מולידה אבות נוירון גרגר המוח הקטן, אשר יהוו את האוכלוסייה עצבית הרבות ביותר בהמוח הקטן בוגר 9. בעקבות הגירה מקורי, הם להתיישב בanlage המוח הקטן. הנה, מיטוזה של מבשרי נוירון הגרגר מובילה להתרחבות הדרמטית של השכבה החיצונית הפרטנית (EGL), המתרחש לאחר לידה במכרסמים. מEGL, הנוירונים להתחיל נודדים פנימה דרך השכבה המולקולרית (מ"ל), בעבר בשכבת תא פורקינג' סופו של דבר לקחת את מגוריו בשכבת גרגרים הפנימיים (IGL 2). במהלך תהליך נדידה זו, הם רוכשים צורה דו קוטבית עם שני אקסונים הארכה לML. על הגירה נוספת, גוף התא נודד הרחק מאקסונים ושני תהליכי הפתיל כדי ליצור האקסון אחד מפוצל, בצורת אות T 10. בהמשך לכך, אקסונים אלה fasciculate ומכונים סיבים במקביל כ. לאחר שהתיישב בIGL, CGNs לגדול דנדריטים, המהווים טפרים הדנדריטים להקים סינפסות עם סיבי אזובי. כדי לבחון תהליכים בסיסיים במוח הקטן מתפתח, בשילוב במבחנה בapproac vivoשעות מאפשרת לתוצאות ומסקנות אמינות.
CGNs הם לא רק נוירונים הרבים ביותר של המוח הקטן, אלא של כל המוח ויכול להיות מתורבת לטוהר גבוה 11-13. בתרבות, אוכלוסייה עצבית הומוגנית מאוד זה הופך במהירות postmitotic ורוכשת מורפולוגיה קוטב עם אקסונים ודנדריטים לזיהוי בקלות. CGNs התרבית הוכיחו להיות מאוד שימושי כדי ללמוד היבטים שונים של התפתחות עצבית הכוללים ריבוי אב, בידול, אקסון ופיתוח דנדריט, נדידת נוירונים, אפופטוזיס ומאפייני אלקטרו (14-19 ועוד רבים אחרים). השימוש במניפולציה גנטית הרחיבה את הרבגוניות של CGNs התרבותי ואיפשר לתובנה מכניסטית נוסף לאירועים האמורים. Transfection של נוירונים בתרבית באמצעות סידן זרחה יעילות נמוכה או שיטות lipophilic אחרי immunocytochemistry עם סמני קוטביות או הוא מסייע ניתוח נתמך תוכנהtates ההערכה למשל המורפולוגיה של נוירונים בודדים בתרבות עצבית צפופה. עם גישה זו, תפקידם של חלבונים של עניין צמיחת האקסון או דנדריט ניתן ללמוד 20-25,26-28. מערכת תרבות אולם זה היא פחות שימושי לנתח נדידת נוירונים כהגירה היא מוגבלת מאוד בתרבויות בצפיפות גבוהה ותדרוש cocultures. הניתוח במבחנה של האקסון וצמיחת דנדריט גם מאפשר הבדיקה של חלבונים ביניהם של מסלול איתות באמצעות שילובים של התערבות RNA (i), על ביטוי או מולקולות קטנות.
כדי לבסס את הרלוונטיות של החלבון של העניין בהאקסון ורגולציה צמיחת דנדריט או נדידת נוירונים, electroporation in vivo הטכניקה (IVE) מאפשר הניתוח בפיתוח המוח הקטן קליפת המוח. בשל העובדה שפיתוח המוח הקטן במכרסמים משתרע דרך כלשבועות לאחר הלידה הראשון, המוח הקטן מייצג accessibמבנה המוח le למניפולציות גנטיות כדי לבחון פיתוח אקסונים ודנדריטים, נדידת נוירונים, synaptogenesis ואפופטוזיס 20-24,29,30,26,27,31-34. בנוסף, מערכת מודל זה שימושי גם להיבטים אחרים של התפתחות עצבית הדורשים את קליפת המוח הקטן בשלמותה כגון pathfinding האקסון, חיווט וקישוריות של תאי עצב ונוירון, גליה אינטראקציות יחדיו, פרוטוקול זה מספק במבחנה בטכניקות vivo כדי להתמודד עם גישה משלימה לגבי המורפוגנזה ונדידת נוירונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
יתרונות ומגבלות של תאר במבחנה בשיטות vivo:
CGNs תרבית מעכבר והחולדות מתאימים באותה מידה גם עבור ניתוחים מורפולוגיים. בשל הגודל גדול יותר של המוח הקטן עכברוש, התשואה של CNGs מגורי חולדה עולה על זו של גורי עכבר 3-4x. מלבד CGNs, ניתן להשתמ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו מודים N. Schwedhelm-Domeyer לקבלת סיוע טכני מעולה, ג האמר וש 'פאפיול לעזרה בניתוחים סטטיסטיים. העבודה שלנו ממומנת על ידי אגודת מקס פלנק, Forschungsgemeinschaft דויטשה, מרכז ננו מיקרוסקופית, מולקולרי ופיזיולוגיה של המוח (CNMPB), גטינגן, גרמניה ועל ידי ג 'וניור קבוצת מלגת GGNB של אוניברסיטת גטינגן.
Materials
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isofluorane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
| SP2 confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
| Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 needle, 30 gauge | BD | 302200 | |
| 50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
Referências
- Cajal, S. R. . Histology of the nervous system of man and vertebrates. , (1995).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. , (2012).
- Palay, S. L., Chan-Palay, V. . Cerebellar cortex: cytology and organization. , (1974).
- Hatten, M. E., Alder, J., Zimmerman, K., Heintz, N. Genes involved in cerebellar cell specification and differentiation. Curr. Opin. Neurobiol. 7, 40-47 (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu. Rev. Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Sillitoe, R. V., Joyner, A. L. Morphology molecular codes, and circuitry produce the three-dimensional complexity of the cerebellum. Ann. Rev. Dev. Biol. 23, 549-577 (2007).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Kawaji, K., Umeshima, H., Eiraku, M., Hirano, T., Kengaku, M. Dual phases of migration of cerebellar granule cells guided by axonal and dendritic leading processes. Mol. Cell Neurosci. 25, 228-240 (2004).
- Hatten, M. E., Gao, W. -. Q., Morrison, M. E., Mason, C. A. Cellular and molecular neuroscience. , 419-41 .
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J. Vis. Exp. , (2009).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Rivas, R. J., Hatten, M. E. Motility and cytoskeletal organization of migrating cerebellar granule neurons. J. Neurosci. 15, 981-989 (1995).
- Kuhar, S. G., et al. Changing patterns of gene expression define four stages of cerebellar granule neuron differentiation. Development. 117, 97-104 (1993).
- Baird, D. H., Hatten, M. E., Mason, C. A. Cerebellar target neurons provide a stop signal for afferent neurite extension in vitro. J. Neurosci. 12, 619-634 (1992).
- Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. J. Neurosci. 15, 4970-4981 (1995).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Smith, T. C., Wang, L. Y., Howe, J. R. Distinct kainate receptor phenotypes in immature and mature mouse cerebellar granule cells. Physiol. 517 (1), 51-58 (1999).
- Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain). Science. 303, 1026-1030 (2004).
- Stegmuller, J., Huynh, M. A., Yuan, Z., Konishi, Y., Bonni, A. TGFbeta-Smad2 signaling regulates the Cdh1-APC/SnoN pathway of axonal morphogenesis. J. Neurosci. 28, 1961-1969 (2008).
- Stegmuller, J., et al. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-400 (2006).
- Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Nakazawa, T., Stegmuller, J. p250GAP is a novel player in the Cdh1-APC/Smurf1 pathway of axon growth regulation. PLoS One. 7, (2012).
- Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Stegmuller, J. The E3 ligase Cdh1-anaphase promoting complex operates upstream of the E3 ligase Smurf1 in the control of axon growth. Development. 139, 3600-3612 (2012).
- Gaudilliere, B., Konishi, Y., de la Iglesia, N., Yao, G., Bonni, A. A. CaMKII-NeuroD Signaling Pathway Specifies Dendritic Morphogenesis. Neuron. 41, 229-241 (2004).
- Yang, Y., et al. A Cdc20-APC ubiquitin signaling pathway regulates presynaptic differentiation. Science. 326, 575-578 (2009).
- Litterman, N., et al. An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning. PLoS Biol. 9, (2011).
- Kim, A. H., et al. A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons. Cell. 136, 322-336 (2009).
- Shalizi, A., et al. A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation. Science. 311, 1012-1017 (2006).
- Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration. PLoS One. 8, (2013).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nat. Neurosci. , (2011).
- Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).
- Huynh, M. A., et al. An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain. Neuron. 69, 930-944 (2011).
- de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain. Neuron. 72, 22-40 (2011).
- Calissano, P., et al. Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).
