Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em> In Vitro</em> E<em> In Vivo</em> Per studiare neuronale Morfologia e migrazione
Summary
Morfogenesi neuronale e la migrazione sono eventi cruciali alla base un corretto sviluppo del cervello. Qui, descriviamo i metodi per manipolare geneticamente colture di neuroni granulari del cervelletto e del cervelletto in via di sviluppo per la valutazione della morfologia e delle caratteristiche migratorie dei neuroni.
Abstract
Eventi dello sviluppo del cervello, tra cui la morfogenesi neuronale e migrazione sono processi altamente orchestrati. In vitro e in vivo analisi consentono di una caratterizzazione approfondita per identificare meccanismi coinvolti in questi eventi. Neuroni granulari cerebellari (CGN) che sono derivati dal cervelletto di sviluppo sono un sistema modello ideale che consente analisi morfologiche. Qui, descriviamo un metodo di come manipolare geneticamente CGN e come studiare axono-e dendritogenesis dei singoli neuroni. Con questo metodo gli effetti dell'interferenza RNA, sovraespressione o piccole molecole possono essere confrontati per controllare neuroni. Inoltre, la corteccia cerebellare roditore è facilmente accessibile de sistema vivo a causa del suo sviluppo postnatale predominante. Vi presentiamo anche una tecnica di elettroporazione in vivo per manipolare geneticamente il cerebella sviluppo e descrivere la successiva cerebellare analisi per valutare la morfologia neuronale unand migrazione.
Introduction
Il cervelletto è un ottimo sistema per studiare i meccanismi di crescita degli assoni e la migrazione. Il cervelletto è stata oggetto di studi anatomici fin dagli albori delle neuroscienze 1. Microscopia moderna e tecniche di immunoistochimica hanno notevolmente ampliato e perfezionato le scoperte iniziali di Santiago, Ramon e Cajal 2-4. Genetica del topo e studi molecolari scoperti fattori di crescita e di trascrizione essenziali nel controllo dello sviluppo del cervelletto, che ha portato ad una maggiore comprensione degli eventi cruciali necessari per il corretto cablaggio dei diversi tipi di neuroni, tra cui neuroni granulari del cervelletto (CGN) 5-7.
Il cervelletto è un derivato di rhombomere 1 della hindbrain sviluppo 8. Il labbro rombico, che è parte del tetto del 4 ° ventricolo, dà origine a progenitori neuronali dei granuli cerebellari, che costituiranno la più numerosa popolazione neuronale nelcervelletto adulto 9. Dopo la migrazione rostrale, si depositano nel anlage cerebellare. Qui, mitosi di precursori neuronali dei granuli porta alla drammatica espansione dello strato granulare esterno (EGL), che avviene dopo la nascita nei roditori. Dal EGL, i neuroni iniziano la migrazione verso l'interno attraverso lo strato molecolare (ML), oltre lo strato di cellule di Purkinje a prendere in ultima analisi, la residenza nello strato granulare interno (IGL 2). Durante questo processo migratorio, acquisiscono una forma bipolare con due assoni si estende nella ML. Su ulteriore migrazione, il corpo cellulare migra distanti assoni ei due processi fondono per formare uno biforcato, assone forma di T 10. Successivamente, questi assoni fasciculate e sono indicate come fibre parallele. Stabilitosi nel IGL, CGN crescere dendriti, che formano artigli dendritiche stabilire sinapsi con le fibre di muschio. Per esaminare processi fondamentali nel cervelletto sviluppo, un combinato in vitro e in vivo approach consente di ottenere risultati affidabili e conclusioni.
CGN sono non solo più numerosi neuroni del cervelletto ma dell'encefalo e possono essere coltivate a elevata purezza 11-13. Nella cultura, questa popolazione neuronale molto omogenea diventa rapidamente postmitotico e acquisisce una morfologia polare con assoni e dendriti facilmente identificabili. CGN coltura hanno dimostrato di essere estremamente utile per studiare i vari aspetti dello sviluppo neuronale, tra cui la proliferazione progenitore, la differenziazione, assonale e lo sviluppo dei dendriti, migrazione neuronale, l'apoptosi e le proprietà elettrofisiologiche (14-19 e molti altri). L'uso della manipolazione genetica ha ampliato la versatilità di CGN colti e consentito per una visione più meccanicistica nei suddetti eventi. La trasfezione di neuroni in coltura con bassa efficienza fosfato di calcio o metodi lipofile seguiti da immunocitochimica con marcatori polarità o software supportato da analisi di facilitareTATI la valutazione ad esempio la morfologia dei singoli neuroni in coltura neuronale denso. Con questo approccio, il ruolo delle proteine di interesse in assoni e dendriti crescita può essere studiato 20-25,26-28. Questo sistema di coltura però è meno utile per analizzare migrazione neuronale, come la migrazione è molto limitata nelle culture ad alta densità e richiederebbe co-colture. L'analisi in vitro di assoni e dendriti crescita consente anche per l'esame di proteine interconnessi di una via di segnalazione utilizzando combinazioni di RNA interference (i), sovra-espressione o piccole molecole.
Per stabilire la rilevanza della proteina di interesse in assoni e dendriti regolazione della crescita o la migrazione neuronale, l'elettroporazione in vivo (IVE) tecnica permette l'analisi in via di sviluppo corteccia cerebellare. Per il fatto che lo sviluppo cerebellare nei roditori estende strada nelle prime due settimane dopo la nascita, il cervelletto rappresenta un accessibstruttura del cervello per le manipolazioni genetiche per esaminare lo sviluppo di assoni e dendriti, migrazione neuronale, sinaptogenesi e apoptosi 20-24,29,30,26,27,31-34. Inoltre, questo modello di sistema è utile anche per altri aspetti dello sviluppo neuronale che richiedono la corteccia cerebellare intatta come assone pathfinding, il cablaggio e la connettività dei neuroni e delle interazioni neuroni-glia Preso insieme, questo protocollo prevede in vitro e in vivo le tecniche per affrontare un approccio complementare per quanto riguarda la morfogenesi neuronale e la migrazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vantaggi e limitazioni del descritto in vitro e in vivo:
CGN Colta da mouse e ratti sono ugualmente adatti per le analisi morfologiche. A causa della dimensione più grande di un cervelletto di ratto, la resa di CNGS da cuccioli di ratto supera quello dei cuccioli di topo 3-4x. A parte CGN, neuroni corticali e ippocampali possono essere utilizzati come sistema cultura. Il metodo di fosfato di calcio si traduce in un basso (0,01-5%) efficienza di trasfezione, che è desidera…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo N. Schwedhelm-Domeyer per l'eccellente assistenza tecnica, C. Martello e S. Papiol per un aiuto con analisi statistiche. Il nostro lavoro è finanziato dalla Max Planck Society, la Deutsche Forschungsgemeinschaft, il Center for Nanoscale Microscopia e Fisiologia Molecolare del cervello (CNMPB), Göttingen, Germania e dal GGNB Junior Gruppo Stipend dell'Università di Göttingen.
Materials
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isofluorane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
| SP2 confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
| Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 needle, 30 gauge | BD | 302200 | |
| 50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
Referências
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