Genetisk manipulering av Lillehjernen Granule Neuroner<em> In Vitro</em> Og<em> I Vivo</em> Å studere nevrale morfologi og migrasjon
Summary
Nevronale morphogenesis og migrasjon er avgjørende hendelser som ligger til grunn riktig hjernens utvikling. Her beskriver vi metoder for å manipulere genetisk dyrkede lillehjernen granule neuroner og utviklingslillehjernen for vurdering av morfologi og trekkende karakteristikker av nerveceller.
Abstract
Utviklings hendelser i hjernen inkludert nevronale morphogenesis og migrasjon er sterkt orkestrert prosesser. In vitro og in vivo-analyser gir mulighet for en grundig karakterisering å identifisere stier involvert i disse hendelsene. Lillehjernen granule neuroner (CGNs) som er utledet fra utviklingslillehjernen er en ideell modell system som gjør det mulig for morfologiske analyser. Her beskriver vi en metode for hvordan man skal manipulere genetisk CGNs og hvordan å studere axono-og dendritogenesis av enkelte nerveceller. Med denne metoden effekten av RNA-interferens, overekspresjon eller små molekyler kan bli sammenlignet med kontroll neuroner. I tillegg er den gnager cerebellar cortex en lett tilgjengelig in vivo-system på grunn av sin dominerende postnatal utvikling. Vi presenterer også en in vivo electroporation teknikk for å manipulere genetisk utviklings cerebella og beskrive påfølgende lillehjernen analyser for å vurdere neuronal morfologi ennd migrasjon.
Introduction
Den cerebellum er et utmerket system for å studere mekanismene for axon vekst og migrering. Lillehjernen har vært gjenstand for anatomiske studier siden tidenes morgen nevro en. Moderne mikroskopi og immunhistokjemiske teknikker har betydelig utvidet og videreutviklet de første funnene av Santiago, Ramon, og Cajal 2-4. Muse genetikk og molekylær studier avdekket vesentlige vekst og transkripsjonsfaktorer i kontroll av lillehjernen utvikling, noe som førte til større forståelse for viktige hendelser som kreves for riktig kabling av forskjellige typer nevroner inkludert lillehjernen granule neuroner (CGNs) 5-7.
Lillehjernen er et derivat av rhombomere en av utviklings hindbrain åtte. Den rombiske leppe, som er en del av taket av 4 th hjertekammer, gir opphav til cerebellare granule neuron stamceller, som vil utgjøre den mest tallrike neuronal populasjon ivoksen cerebellum ni. Etter rostral migrasjon, de ender opp i lillehjernen anlage. Her, mitose av granule neuron forløpere fører til dramatisk utvidelse av den eksterne granulær laget (EGL), som finner sted etter fødselen hos gnagere. Fra EGL, nerveceller begynner å migrere innover gjennom den molekylære lag (ML), forbi Purkinje cellelaget til slutt å ta seg ned i det indre granulære sjikt (IGL 2). I løpet av denne trekkprosessen, skaffe de en bipolar form med to axoner som strekker seg inn i den ML. Ved videre migrering, migrerer cellelegemet bort fra axoner og de to prosesser som smelter for å danne en gaffelformet, T-formet axon 10.. Deretter ble disse axoner fasciculate og blir referert til som parallelle fibre. Etter å ha avgjort i IGL, CGNs vokse dendritter, som danner dendrittiske klør for å etablere synapser med mosegrodde fibre. For å undersøke de grunnleggende prosesser i utviklingen av lillehjernen, et kombinert in vitro og in vivo approach åpner for pålitelige resultater og konklusjoner.
CGNs ikke bare er de mest tallrike nevroner i cerebellum, men i hele hjernen og kan bli dyrket til høy renhet 11-13. I kultur, blir dette svært homogen nevronale befolkningen raskt postmitotic og får en polar morfologi med lett identifiserbare axoner og dendritter. Dyrkede CGNs har vist seg å være svært nyttig å studere ulike aspekter av nevronale utvikling inkludert stamfar spredning, differensiering, aksonal og Dendritt utvikling, neuronal migrasjon, apoptose og elektrofysiologiske egenskaper (14-19 og mange andre). Bruk av genetisk manipulasjon har utvidet allsidighet av dyrkede CGNs og lov for videre mekanistisk innsikt i de nevnte hendelsene. Transfeksjon av dyrkede nevroner bruker laveffektivt kalsiumfosfat eller lipofile metoder etterfulgt av immunocytochemistry med polaritet markører eller programvare-støttet analyse facilitates vurderingen av f.eks morfologien av individuelle nevroner i en tett neuronal kultur. Med denne tilnærmingen, kan rollen som proteiner av interesse i akson eller Dendritt vekst studeres 20-25,26-28. Denne kulturen systemet er imidlertid mindre nyttig å analysere neuronal migrasjon som migrasjon er svært begrenset i høy tetthet kulturer og ville kreve cocultures. Den in vitro-analyse av akson-og dendritt vekst gjør det også mulig for undersøkelse av sammenknyttede proteiner av en signalveien ved hjelp av kombinasjoner av RNA interferens (i), over-ekspresjon eller små molekyler.
Å etablere relevansen av proteinet av interesse i akson og Dendritt vekstregulering eller neuronal migrasjon, in vivo electroporation (IVE) teknikken gjør det mulig for analysen i utviklingslillehjernen cortex. På grunn av det faktum at cerebellar utvikling hos gnagere strekker seg helt inn i de to første uker etter fødselen, representerer cerebellum en accessible hjernestruktur for genetiske manipulasjoner for å undersøke utviklingen av aksoner og dendritter, neuronal migrasjon, synaptogenesis og apoptose 20-24,29,30,26,27,31-34. I tillegg er også nyttig for andre aspekter av neuronal utvikling som krever intakt lillehjernen cortex som axon pathfinding, kabling og tilkobling av nerveceller og nervecellen-gliaceller interaksjoner tatt sammen denne modellen system, gir denne protokollen in vitro og in vivo teknikker for å takle en komplementær tilnærming om nevronale morphogenesis og migrasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fordeler og ulemper ved den beskrevne in vitro-og in vivo-metoder:
Dyrkede CGNs fra mus og rotter er like godt egnet for morfologiske analyser. På grunn av større størrelse med en rotte lillehjernen, utbyttet av CNG og står fra rotteunger overgår museunger 3-4x. Bortsett fra CGNs kan kortikale og hippocampus-neuroner bli brukt som kultursystem i tillegg. Den kalsiumfosfatmetoden resulterer i en lav (0,01 til 5%) transfeksjon effektivitet, noe som er ønsket å analysere morfolo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker N. Schwedhelm-Domeyer for utmerket teknisk assistanse, C. Hammer og S. Papiol for hjelp med statistiske analyser. Vårt arbeid er finansiert av Max Planck Society, Deutsche Forschungsgemeinschaft, Senter for nanoskala Mikros, og molekylær fysiologi av hjernen (CNMPB), Göttingen, Tyskland og ved GGNB Junior Gruppe stipend på Universitetet i Göttingen.
Materials
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isofluorane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
| SP2 confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
| Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 needle, 30 gauge | BD | 302200 | |
| 50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
Referências
- Cajal, S. R. . Histology of the nervous system of man and vertebrates. , (1995).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. , (2012).
- Palay, S. L., Chan-Palay, V. . Cerebellar cortex: cytology and organization. , (1974).
- Hatten, M. E., Alder, J., Zimmerman, K., Heintz, N. Genes involved in cerebellar cell specification and differentiation. Curr. Opin. Neurobiol. 7, 40-47 (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu. Rev. Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Sillitoe, R. V., Joyner, A. L. Morphology molecular codes, and circuitry produce the three-dimensional complexity of the cerebellum. Ann. Rev. Dev. Biol. 23, 549-577 (2007).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Kawaji, K., Umeshima, H., Eiraku, M., Hirano, T., Kengaku, M. Dual phases of migration of cerebellar granule cells guided by axonal and dendritic leading processes. Mol. Cell Neurosci. 25, 228-240 (2004).
- Hatten, M. E., Gao, W. -. Q., Morrison, M. E., Mason, C. A. Cellular and molecular neuroscience. , 419-41 .
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J. Vis. Exp. , (2009).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Rivas, R. J., Hatten, M. E. Motility and cytoskeletal organization of migrating cerebellar granule neurons. J. Neurosci. 15, 981-989 (1995).
- Kuhar, S. G., et al. Changing patterns of gene expression define four stages of cerebellar granule neuron differentiation. Development. 117, 97-104 (1993).
- Baird, D. H., Hatten, M. E., Mason, C. A. Cerebellar target neurons provide a stop signal for afferent neurite extension in vitro. J. Neurosci. 12, 619-634 (1992).
- Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. J. Neurosci. 15, 4970-4981 (1995).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Smith, T. C., Wang, L. Y., Howe, J. R. Distinct kainate receptor phenotypes in immature and mature mouse cerebellar granule cells. Physiol. 517 (1), 51-58 (1999).
- Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain). Science. 303, 1026-1030 (2004).
- Stegmuller, J., Huynh, M. A., Yuan, Z., Konishi, Y., Bonni, A. TGFbeta-Smad2 signaling regulates the Cdh1-APC/SnoN pathway of axonal morphogenesis. J. Neurosci. 28, 1961-1969 (2008).
- Stegmuller, J., et al. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-400 (2006).
- Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Nakazawa, T., Stegmuller, J. p250GAP is a novel player in the Cdh1-APC/Smurf1 pathway of axon growth regulation. PLoS One. 7, (2012).
- Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Stegmuller, J. The E3 ligase Cdh1-anaphase promoting complex operates upstream of the E3 ligase Smurf1 in the control of axon growth. Development. 139, 3600-3612 (2012).
- Gaudilliere, B., Konishi, Y., de la Iglesia, N., Yao, G., Bonni, A. A. CaMKII-NeuroD Signaling Pathway Specifies Dendritic Morphogenesis. Neuron. 41, 229-241 (2004).
- Yang, Y., et al. A Cdc20-APC ubiquitin signaling pathway regulates presynaptic differentiation. Science. 326, 575-578 (2009).
- Litterman, N., et al. An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning. PLoS Biol. 9, (2011).
- Kim, A. H., et al. A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons. Cell. 136, 322-336 (2009).
- Shalizi, A., et al. A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation. Science. 311, 1012-1017 (2006).
- Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration. PLoS One. 8, (2013).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nat. Neurosci. , (2011).
- Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).
- Huynh, M. A., et al. An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain. Neuron. 69, 930-944 (2011).
- de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain. Neuron. 72, 22-40 (2011).
- Calissano, P., et al. Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).
