Genetic Manipulation av Cerebellar granulneuroner<em> In Vitro</em> Och<em> In Vivo</em> Att studera neuronal morfologi och migration
Summary
Neuronal morfogenes och migration är viktiga händelser som ligger till grund för korrekt hjärnans utveckling. Här beskriver vi metoder för att genetiskt manipulera odlade cerebellära granulat nervceller och utvecklingslillhjärnan för bedömning av morfologi och flyttande egenskaper nervceller.
Abstract
Utvecklings händelser i hjärnan, inklusive neuronala morfogenes och migration är mycket iscensatt processer. In vitro och in vivo-analyser möjliggöra en fördjupad karaktärisering för att identifiera involverade i dessa händelser. Cerebellära granulneuroner (CGNs) som kommer från utvecklingslillhjärnan är ett perfekt modellsystem som gör det möjligt för morfologiska analyser. Här beskriver vi en metod för hur man genetiskt manipulera CGNs och hur man studerar axono-och dendritogenesis av enskilda neuroner. Med denna metod effekterna av RNA-interferens, överuttryck eller små molekyler kan jämföras för att styra neuroner. Dessutom är ett lättillgängligt in vivo-system på grund av sin dominerande utveckling efter födsel gnagare cerebellar cortex. Vi presenterar också en in vivo-elektroporering teknik för att genetiskt manipulera utveckla cerebella och beskriva efterföljande cerebellär analyser för att bedöma neuronal morfologi and migration.
Introduction
Lillhjärnan är ett utmärkt system för att studera mekanismerna för axon tillväxt och migration. Lillhjärnan har varit föremål för anatomiska studier sedan början av neuroscience 1. Modern mikroskopi och immunhistokemiska tekniker har kraftigt expanderat och förfinat de första upptäckterna av Santiago, Ramon, och Cajal 2-4. Mus genetik och molekylära studier avslöjade viktiga tillväxt-och transkriptionsfaktorer i kontrollen av cerebellar utveckling, vilket lett till ökad förståelse för viktiga händelser som krävs för korrekt inkoppling av olika typer av nervceller, inklusive cerebellära granulneuroner (CGNs) 5-7.
Lillhjärnan är ett derivat av rhombomere en av framkallnings bakhjäman 8. Den rombiska läpp, som är en del av taket på 4: e ventrikeln, ger upphov till cerebellär granulat neuron progenitorceller, som kommer att utgöra den mest talrika neuronala befolkningen ivuxen lillhjärnan 9. Efter rostral migration, de sätter sig i lillhjärnan anlage. Här mitos av granul neuron prekursorer leder till dramatisk expansion av den yttre granulära skiktet (EGL), som äger rum postnatalt hos gnagare. Från EGL, nervceller börjar migrera inåt genom den molekylära lagret (ML), förbi Purkinje cellager att slutligen bosätta sig på den inre granulära skiktet (IGL 2). Under denna vandrande process, de får en bipolär form med två axoner sträcker sig in i ML. Vid ytterligare migration, migrerar cellkroppen bort från axoner och de två processerna smälter bildar en gaffelformad, T-formad Axon 10. Därefter dessa axoner fasciculate och kallas parallella fibrer. Efter att ha bosatt sig i IGL, CGNs växa dendriter, som utgör dendritiska klor för att etablera synapser med mossiga fibrer. För att undersöka de grundläggande processerna i framkallnings cerebellum, en kombinerad in vitro och in vivo approach möjliggör tillförlitliga resultat och slutsatser.
CGNs är inte bara de många nervceller i lillhjärnan, men i hela hjärnan och kan odlas till hög renhet 11-13. I kultur, blir detta mycket homogen neuronala befolkningen snabbt postmitotisk och förvärvar en polär morfologi med lätt identifierbara axoner och dendriter. Odlade CGNs har visat sig vara mycket användbart för att studera olika aspekter av neuronal utveckling inklusive stamfader proliferation, differentiering, axonal och Dendrite utveckling, neuronal migration, apoptos och elektrofysiologiska egenskaper (14-19 och många andra). Användningen av genetisk manipulation har utökat mångsidighet odlade CGNs och tillåtet för ytterligare mekanistiska inblick i ovan nämnda händelser. Transfektion av odlade nervceller med hjälp av låg verkningsgrad kalciumfosfat eller lipofila metoder följt av immunocytokemi med polaritet markörer eller mjukvarustödd analys underlättalättar bedömningen av t.ex. morfologi av enskilda nervceller i en tät neuronal kultur. Med denna metod kan studeras rollen av proteiner av intresse för axon eller Dendrite tillväxt 20-25,26-28. Denna kultur-systemet är dock mindre lämpligt att analysera neuronal migration som migration är mycket begränsad i hög densitet kulturer och kräver samodlingar. Analysen av axon och dendrit tillväxt in vitro möjliggör också granskning av sammankopplade proteiner i en signalväg som använder kombinationer av RNA-interferens (i), överuttryck eller små molekyler.
För att fastställa relevansen av proteinet av intresse i axon och dendrit tillväxtreglering eller neuronal migration, in vivo elektroporering (IVE) teknik gör det möjligt för analysen i utvecklings cerebellar cortex. På grund av det faktum att cerebellar utveckling hos gnagare sträcker sig in i de två första postnatala veckorna representerar cerebellum en accessible hjärnans struktur för genetiska manipulationer för att undersöka utvecklingen av axoner och dendriter, neuronal migration, synaptogenesis och apoptos 20-24,29,30,26,27,31-34. Dessutom är detta modellsystem också användbart för andra aspekter av neuronal utveckling som kräver intakt cerebellar cortex t.ex. Axon pathfinding, ledningar och anslutningar av nervceller och neuron-Glia interaktioner Sammantaget ger detta protokoll in vitro och in vivo-tekniker för att ta itu med en kompletterande strategi avseende neuronala morfogenes och migration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fördelar och begränsningar för den beskrivna in vitro-och in vivo-metoder:
Odlade CGNs från mus och råtta är lika väl lämpade för morfologiska analyser. På grund av den större storleken på en råttcerebellum var utbytet av CNGs från råttungar överstiger vikten av musungar 3-4x. Bortsett från CGNs kan kortikala och hippocampus nervceller användas som odlingssystemet också. Den kalciumfosfatmetoden resulterar i en låg (0,01-5%) transfektionseffektivitet, vilket är …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar N. Schwedhelm-Domeyer för utmärkt tekniskt stöd, C. Hammer och S. Papiol för hjälp med statistiska analyser. Vårt arbete finansieras av Max Planck-sällskapet, Deutsche Forschungsgemeinschaft, Centrum för nano mikroskopi, och Molekylär fysiologi av hjärnan (CNMPB), Göttingen, Tyskland och av GGNB Junior Group stipendium på universitetet i Göttingen.
Materials
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isofluorane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
| SP2 confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
| Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 needle, 30 gauge | BD | 302200 | |
| 50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
Referências
- Cajal, S. R. . Histology of the nervous system of man and vertebrates. , (1995).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. , (2012).
- Palay, S. L., Chan-Palay, V. . Cerebellar cortex: cytology and organization. , (1974).
- Hatten, M. E., Alder, J., Zimmerman, K., Heintz, N. Genes involved in cerebellar cell specification and differentiation. Curr. Opin. Neurobiol. 7, 40-47 (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu. Rev. Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Sillitoe, R. V., Joyner, A. L. Morphology molecular codes, and circuitry produce the three-dimensional complexity of the cerebellum. Ann. Rev. Dev. Biol. 23, 549-577 (2007).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Kawaji, K., Umeshima, H., Eiraku, M., Hirano, T., Kengaku, M. Dual phases of migration of cerebellar granule cells guided by axonal and dendritic leading processes. Mol. Cell Neurosci. 25, 228-240 (2004).
- Hatten, M. E., Gao, W. -. Q., Morrison, M. E., Mason, C. A. Cellular and molecular neuroscience. , 419-41 .
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J. Vis. Exp. , (2009).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Rivas, R. J., Hatten, M. E. Motility and cytoskeletal organization of migrating cerebellar granule neurons. J. Neurosci. 15, 981-989 (1995).
- Kuhar, S. G., et al. Changing patterns of gene expression define four stages of cerebellar granule neuron differentiation. Development. 117, 97-104 (1993).
- Baird, D. H., Hatten, M. E., Mason, C. A. Cerebellar target neurons provide a stop signal for afferent neurite extension in vitro. J. Neurosci. 12, 619-634 (1992).
- Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. J. Neurosci. 15, 4970-4981 (1995).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Smith, T. C., Wang, L. Y., Howe, J. R. Distinct kainate receptor phenotypes in immature and mature mouse cerebellar granule cells. Physiol. 517 (1), 51-58 (1999).
- Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain). Science. 303, 1026-1030 (2004).
- Stegmuller, J., Huynh, M. A., Yuan, Z., Konishi, Y., Bonni, A. TGFbeta-Smad2 signaling regulates the Cdh1-APC/SnoN pathway of axonal morphogenesis. J. Neurosci. 28, 1961-1969 (2008).
- Stegmuller, J., et al. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-400 (2006).
- Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Nakazawa, T., Stegmuller, J. p250GAP is a novel player in the Cdh1-APC/Smurf1 pathway of axon growth regulation. PLoS One. 7, (2012).
- Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Stegmuller, J. The E3 ligase Cdh1-anaphase promoting complex operates upstream of the E3 ligase Smurf1 in the control of axon growth. Development. 139, 3600-3612 (2012).
- Gaudilliere, B., Konishi, Y., de la Iglesia, N., Yao, G., Bonni, A. A. CaMKII-NeuroD Signaling Pathway Specifies Dendritic Morphogenesis. Neuron. 41, 229-241 (2004).
- Yang, Y., et al. A Cdc20-APC ubiquitin signaling pathway regulates presynaptic differentiation. Science. 326, 575-578 (2009).
- Litterman, N., et al. An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning. PLoS Biol. 9, (2011).
- Kim, A. H., et al. A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons. Cell. 136, 322-336 (2009).
- Shalizi, A., et al. A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation. Science. 311, 1012-1017 (2006).
- Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration. PLoS One. 8, (2013).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nat. Neurosci. , (2011).
- Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).
- Huynh, M. A., et al. An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain. Neuron. 69, 930-944 (2011).
- de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain. Neuron. 72, 22-40 (2011).
- Calissano, P., et al. Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).
