細胞培養物衝撃波アプリケーション
Summary
衝撃波は、今日ではその再生効果によく知られている。従ってインビトロ実験は、関心の高まりである。そこで我々は、それによって気が散るの物理的効果を回避すること、生体内の状態に模倣することを可能にin vitroでの衝撃波試験（IVSWT）のためのモデルを開発しました。
Abstract
衝撃波は、今日ではその再生効果によく知られている。基礎研究の知見は、衝撃波は、任意の後続の損傷なしに細胞または組織を標的とする生物学的刺激を引き起こすということを示した。従って、 インビトロ実験は、増大興味深い。細胞培養物上に衝撃波を印加する様々な方法が記載されている。一般的に、既存のすべてのモデルは、最高の細胞上に衝撃波を適用する方法に焦点を当てています。
しかし、この疑問が残っている：どのような細胞培養を通過した後の波はどうなりますか？細胞培養培地と周囲空気の音響インピーダンスの差は、衝撃波の99％以上が反射始めることが、高いことである！そこで我々は、主に波が細胞培養を通過した後、水中に伝播することを可能にするプレキシグラス構築された容器で構成されていたモデルを開発しました。これはキャビテーション効果だけでなく、そうでなければ、今後のものを乱す音波の反射を避けることができます。ウィスコンシン州このモデル番目の我々は、生体内条件を模倣し、それによって衝撃波の物理的刺激が生体細胞の信号（「メカノ」）に変換されます方法についてのより多くの知識を得ることができます。
Introduction
衝撃波は、例えば 、エネルギーの突然の解放に起因する音圧の波である。雷などの時に雷。医学では衝撃波が腎臓結石の崩壊のために砕石術において30年以上にわたって使用されてきた。 1980年代初頭における砕石術の患者における腸骨肥厚の偶発的所見ので、最初の研究は、骨の治癒1上の衝撃波処理（SWT）の効果を評価するために行った。長い骨の癒着不能の改善された癒しの印象的な結果は、2を観察することができた。その後、表示は軟部組織の傷3に拡大した。基礎研究の知見は、衝撃波は、任意の後続のダメージを与えることなく標的組織に生物学的刺激を引き起こすということを示した。血管新生増殖因子（ 例えば VEGF、PlGFは、FGF）の放出を有意血管形成が続く。これは、虚血性の病状に向けた指標の一層の拡大につながった。私たちのグループなどが、正EFFを示したECT動物モデルにおける虚血性心疾患に対するSWTのだけでなく、臨床試験4-6の。
しかし、SWTの物理的刺激が生体信号（メカノ）に変換されるかの正確なメカニズムは、大部分が未知のままである。継続的に薬が増加のいくつかの分野から、SWTの関心としては、メカニズムの探求はますます強烈になっている。したがって、 インビトロ衝撃波実験は重要性を増している。動物実験および費用対効果の低減に加えて、 インビトロ衝撃波処理（IVSWT）の最大の利点は、特定の細胞型の特定の挙動を研究する可能性があってもよい。最も可能性の高い治療された組織のすべての細胞が関与する衝撃波媒介組織再生においても、全身性の効果が記載されている。それにもかかわらず、各細胞型は、特定の役割を果たし、それ自身の固有の機能を有する。 IVSWTは、この特定の関数Aを検出することを可能にND、それによって私たちに複雑な基盤となるプロセスをよりよく理解することができます。
細胞培養物に対する衝撃波の影響についての今日の知識は、増殖の増加、細胞膜受容体の変化、増加および細胞分化の促進、成長因子および化学誘引物質の放出、ならびに増大した細胞遊走7-9を含む。
インビトロのモデルの中で最も邪魔で物理的効果、細胞培養物上に衝撃波を印加する様々な方法が記載されている。この事実は、細胞刺激の物理的条件は、これらのモデルの間でかなり異なっているように、それが結果を比較することは非常に困難であるという問題がある。一般的に、既存のすべてのモデルは、最高の細胞上に衝撃波を適用する方法に焦点を当てています。
しかし、この疑問が残っている：どのような細胞培養を通過した後の波はどうなりますか？主な問題は、音響の違い細胞培養培地と周囲空気のインピーダンスは、衝撃波の99％以上は、図1反射始めることが、高いことである。
による波が反射されるだけでなく、180°の位相シフトを細胞に強い引張力が発生し、その結果を図2つの媒体の音響インピーダンスの差である。
音響インピーダンスは、材料の密度と音速Z =ρX cは積として定義される。水の音響インピーダンスはZWater =144万NS / m 3であり 、空気がそれだけで420-S / M 3である。これら二つの値の差が大きい衝撃波の反射および位相シフトをもたらす。位相シフトは引張波に正圧力パルスをオンにします。
この引張力は、細胞に有害ではないとしても、 インビトロでインビボ衝撃波の効果を模倣するというアイデアに干渉する。 インビボこれら引張力はほとんど、大きな身体構造に起因し発生しません。
さらに、電波を実行し、バックにも入ってくるものを邪魔することができます。これは、干渉を引き起こす可能性があります。干渉の二つのタイプが知られている。建設的干渉は、両方の波が、それによって二倍の振幅を図3にその結果追加されていることを意味します。波は、直径方向に対向満たせば破壊的な干渉が発生する。これは、波の廃止（ 図3）を引き起こす。したがって、IVSWTは、細胞培養を通過した後、伝播する衝撃波を可能にモデルを必要とします。
IVSWT水浴
上記の懸念は、次の考慮事項が記載された問題は、基本的には、衝撃波アプリケータのあらゆる種類を接続するために、膜を容器に構築されたプレキシグラスから構成されています。 図4を回避するための水浴を設計するために私たちを導く。この膜と塗布音波伝送GEとの間の結合のためのlが使用されなければならない。水浴は、ガスを水の中に固溶した場合に生じるキャビテーションを避けるために、脱気水で満たされている。制御ユニットに接続された温度センサと下部のヒーターは、 インビボ条件を模倣するための温度を調節するために、処置中にクールダウンするために細胞培養物を回避することができる。それは培養器で行われるように温度が摂氏37度で安定に保持することができる。細胞サンプルのためのホルダは、培養フラスコ又は管のいずれかの種類を浸漬することを可能にする。これにより、試料容器は、気泡が衝撃波をブロックするように完全培地で充填する必要がある！お風呂の後壁にくさび形の吸収体が順番に反射して干渉を回避するために戻って実行して取得しないように波を破棄。
他のIVSWTモデルに更なる利点は、アプリケータ及び培養フラスコとの間の距離を変化させる可能性がある。私たちのグループの調査結果との明らかに、このモデルを使用して他の人どのようにすべての細胞型が異なる治療パラメータに非常に特異的に反応する。これは衝撃波アプリケータの焦点に関して特定の位置にあると対照細胞することを可能として、さらに、波源と試料との間の距離を定義することが重要である。
Protocol
Representative Results
Discussion
インビトロ衝撃波治療のために提案されたモデルの意義は、波が既存のモデルとは対照的に、細胞培養物を通過した後に伝搬することができるという事実である。それによって、引張力などの物理的妨害の影響を回避することができる。モデルは、より密接に他の人が直接細胞培養フラスコに音波を印加することによってよりも、インビボ条件に似ている。
<p class="jove_content…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、このモデルのためのインスピレーションのためのライナーSchultheissとヴォルフガングSchadenに感謝します。我々はまた、我々の研究を支援するために彼のすべての時間の多大な努力のためのキリスト教ドルフミュラーに感謝します。
私たちのアイデアを慎重に技術的な実現のためのロバートGöschlとハンスHoheneggerに感謝！
Materials
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger – Technical Products | – | |
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipets 25ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | – | |
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| mikrozid disinfectant | Schülke | – | |
| 3,5l degassed water | |||
| paper towels | |||
Referências
- Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39, 529-532 (1992).
- Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union. Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).
- Schaden, W., et al. Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study. J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).
- Tepeköylü, C., et al. Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).
- Nishida, T., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo. Circulation. 110, 3055-3061 (2004).
- Fukumoto, Y., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease. Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).
- Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment. FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).
- Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).
- Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis. Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).
